經典重讀丨Xenobiotica代謝組學開山之作
1999年，來自英國帝國理工學院的J.K. Nicholson教授在Xenobiotica雜志上發表了一篇綜述性文章，文章標題是“'Metabonomics': understanding the metabolic responses of living systems to pathophysiological stimuli via multivariate statistical analysis of biological NMR spectroscopic data”，對其實驗室多年來應用磁共振（NMR）方法研究藥物毒性的成果進行總結和展望，首次提出了代謝組學（Metabonomics）的概念。
經過20多年的發展，隨著檢測技術的發展、分析儀器和軟件性能的不斷提升，代謝組學被廣泛地應用于生物醫學研究，逐漸成為當代生命醫學研究中非常重要的技術方法。Jeremy Nicholson教授因其建立了系統的代謝組學研究方法，開辟了全新的研究領域，當選英國皇家醫學科學院院士，更是著作等身獲獎無數，在國際上享有"代謝組學之父"的稱號。而這篇文章，更是達到了驚人4547次（截止日期：2022.06.09，數據來源google學術），成為代謝組學領域必引文獻。今天，筆者帶大家重新回顧一下見證代謝組學誕生的這篇經典論文。
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引言
隨著基于組合文庫合成方案的應用，藥物研發的快速發展給藥物安全性評估過程帶來了巨大壓力。一旦有潛力的藥物已經通過了初步生物篩選，需要在后續的研發流程中盡量降低候選藥物的淘汰率。因此，發展新的兼顧有效性與安全性的分析技術將極大提高藥物篩選的效率，從而有效降低淘汰率。目前的生物分析方法主要包括測量生命系統在遺傳水平或者細胞蛋白表達水平對藥物的反應，即所謂的基因組學和蛋白質組學方法。雖然現階段基因組學和蛋白質組學方法價格昂貴且費時費力，但仍然是研究生物體對外源性化合物多層次應答的潛在有利工具。但是，即使整合基因組學和蛋白質組學仍然不能為理解生命體整體的細胞功能提供足夠的信息，因為二者并不包括生命整體的動態代謝特征。因此，基于磁共振（NMR）的代謝組學方法的提出可以豐富和補充從遺傳學和蛋白質組學層面所提供的有關生命體對外源化合物應答的信息。代謝組學（metabonomics）定義為“生命系統對病理生理刺激或者遺傳改變的多參數動態代謝應答的定量測量”。這一概念的提出主要是基于過去二十多年來應用1H-NMR譜來研究生物體液、細胞和組織代謝物組成的相關研究（比如以下一些參考文獻：Nicholson et al. 1983, 1985, Bales et al. 1984, Gartland et al. 1989, Nicholson and Wilson 1989, Moka et al. 1998）。另外，代謝組學研究中還使用模式識別（pattern recognition）、專家系統分析（expert system analysis）和相關的生物信息學工具來對復雜的基于NMR的代謝數據集進行解釋和分類（Gartlandet al. 1991, Holmeset al. 1992, 1994, 1998a, b, Anthonyet al. 1994, Spraulet al. 1997, Beckwith-Hallet al. 1998）。代謝組學在代謝調控分析以及其他研究領域也有重要應用價值（Kacser and Burns 1973, Kacser 1993, Goodacreet al. 1996），需要說明的是有另外一個與代謝組學相關的概念，稱為“代謝物組/metabolome”，其代表一個細胞內的全部小分子代謝物。相比之下，代謝組學側重于檢測、鑒定、定量和分類在整合生物系統中而不是單個細胞中代謝改變的動態變化過程。如此多維度的代謝軌跡才能真正反映在病理生理過程中正在發生的生物事件。在此，我們對基于NMR的代謝組學數據特點、毒理學分類和體內生物標志物的鑒定等方面的應用進行簡要介紹。
藥物毒性評估的基因組學和蛋白質組學方法
新的結構分子生物學工具的發展已經使得我們能更加深入地了解基因組的構成。隨著基因測序和鑒定能力的提高，目前超過20種原核生物和線蟲的全基因組測序已經完成。人類基因組包括大約8萬個基因在未來幾年內測序也會全部完成。“基因組學”（genomics）已成為分子生物學發生質變的重要概念之一,其本質是一種測量基因表達的半定量方法，這種方法在藥物發現和毒理學評估中可以檢測藥物暴露后基因表達的變化。
目前應用比較廣泛的基因芯片（gene chips）技術雖然價格昂貴，但是可以快速檢測外源化合物暴露后很多基因表達的改變。然而基因表達與功能基因組學的關系仍然不是十分清楚，即使人類全基因組測序完成后仍然有很長的路要走，因為有大量的非編碼DNA，復雜的基因之間以及基因和非編碼DNA之間的相互作用。由于我們對基因表達變化所導致的生物功能變化還知之甚少，蛋白質組學（proteomics）應運而生。蛋白質組學研究主要半定量分析細胞蛋白對藥物暴露和其他病理生理過程的響應（Anderson et al. 1996, Aicher et al. 1998, Geisow 1998）。多種方法可以用于蛋白質組分析，但是都需要將蛋白分離（比如二維膠電泳）和化學鑒定方法（主要是質譜）相結合。雖然蛋白質組學方法比基因組學方法成本要低，但是現階段仍費時耗力。更為重要的是，雖然基因組學和蛋白質組學研究最后可能為毒理學機制研究提供新的見解，為新的潛在疾病生物標志物的發現提供幫助，但是現階段將基因組和蛋白質組的研究發現直接和毒性分類指數相聯系還十分困難。一個簡單的原因就是現有的方法和技術并沒有測量藥物暴露后詳細的隨時間變化和多器官系統的反應，這對通過代謝改變來評價化合物的毒性來說至關重要，尤其當化合物的初級代謝發生在靶器官以外的其他位置時。比如一類化合物會在肝臟內形成谷胱甘肽的共軛化合物，接下來被β-裂解酶處理后生成活性中間體，而活性中間體最后的毒性靶器官是近端腎小管（Elfarraet al. 1986）。因此，發展新的方法可以對在體內、多器官的整體功能實時檢測非常有必要。基于NMR的代謝組學方法恰好可以滿足上述需求。
基于NMR的代謝組學
外源化合物可以與組織和細胞外成分發生復雜的相互作用，從基因表達到蛋白翻譯甚至整個細胞的生化調控。在這種情況下，生物分子的組成會在多水平發生可以檢測到的變化，“生物組/bionomics”是對所有這些變化的完整描述。有很多藥物通過直接與遺傳物質相互作用或者誘導藥物代謝酶的合成產生毒性產物來發揮其毒性作用。在這種情況下，基因組和蛋白質組研究對藥物毒性評估是有幫助的。但是，外源化合物可以只在藥理水平發揮作用，并不影響基因的調控和表達，顯著的毒理效應也可能與基因表達和蛋白質合成完全不相關。
飲酒可以在體內啟動很多基因的表達，但是這并不能解釋醉酒的原因。因此，在很多時候只考慮基因組和蛋白質組變化并不能有效地預測藥物的毒性。但是所有藥物誘導的病理生理紊亂可以導致內源性生化分子物質比例、濃度、結合力和通量失衡。如果失衡的強調足夠大，毒性效應就會影響整個生命體的正常功能。代謝物在體液與細胞和組織內保持動態平衡，當有毒物質或者代謝刺激導致生命體組織內細胞過程異常時，就會影響生物體液的構成比例。在含有多種潛在干擾物的復雜基質中檢測痕量的分析物是所有分析方法都會遇到的難題。因此，在生物樣品中，比如血液、血漿、尿液、膽汁或器官樣品，針對感興趣的特定類型的分析物選擇合適的分析方法至關重要。高分辨率1H-NMR波譜技術用于研究體液成分異常就非常合適，因為它可以不用做樣品分離，不用做預判就可以同時定量多種代謝物。其他技術比如質譜也可以用于產生代謝數據，但是復雜樣品中不同物質離子化效率的差異會影響檢測和定量的準確性。NMR波譜還可以用于有效地篩選組織提取物和細胞懸液的代謝物輪廓異常。同時也有研究已經成功使用高分辨率魔角旋轉1H-NMR波譜技術研究完整組織（intact tissue）的代謝物組成（Moka et al, 1998）。
Figure 1.大鼠尿液的600 MHz1H-NMR譜圖。
1H-NMR波譜技術檢測內源性代謝物在體液內的精確分布模式受毒素類型和受試動物影響很大（Nicholsonet al. 1983, 1985, Baleset al. 1984, Gartlandet al. 1989, Nicholson and Wilson 1989）。不同類型的毒素會對體液中內源性代謝物的濃度和組成比產生特異性改變，這可以為研究毒理過程發生位置和基本機制提供信息。圖一中所示的為有代表性的毒素處理后的大鼠尿液譜圖。從生物分析方面考慮，產生這樣的信息是非常高效的，每個樣品只需要幾分鐘，不需要或只需要非常少的樣品前處理。對照組的譜圖看起來非常相似，但是不同毒素導致的代謝變化是不同的。因為幾乎所有大類的代謝中間產物都有特異性的NMR譜圖，所以該技術對指紋識別毒素導致的代謝紊亂非常有幫助。
因此，生物體液的1H-NMR波譜分析已經成功在大鼠研究中揭示了大量的器官特異性的代謝生物標志物，NMR作為分析生物化學技術在探索性方面表現卓越。比如氧化三甲胺、二甲基甘氨酸、二甲胺和琥珀酸可以提示腎乳頭損傷，而在之前并沒有有關腎乳頭損傷的生化標志物（Gartland et al. 1989, 1991）。其他通過1H-NMR揭示的尿液標志物包括牛磺酸和肌酸分別與急性肝損傷和睪丸毒性相關（Nicholsonet al. 1989,Grayet al. 1990, Saninset al. 1990）。相似的方法還包括二維磁共振譜。生物體液NMR譜圖中的生物標志物信息遠比上述的要微妙和豐富，因為數以百計的化合物代表的很多代謝途徑可以同時被測量，其代表對毒性刺激的整體代謝組學反應，可以更好的刻畫病變特征。研究這些復雜的多參數數據最有效的方法就是將一維和二維NMR譜與模式識別方法相結合。
NMR代謝組學數據的模式識別和專家系統分析
組織和生物體液一維和二維NMR譜的復雜性是理解其中生化信息的一個限制性因素，即使生物體液的一維1H-NMR譜圖（600MHz或者更高場強）就包含幾千個信號。在研究中一個樣品的NMR譜圖可以被看作是多維的物體，每一個維度代表不同代謝物的濃度（也可以稱為譜峰強調的分布）。因此，組織和生物體液的NMR譜圖可以提供生命體的多維代謝指紋信息，并且由于疾病和毒性過程的不同代謝輪廓會有特異性的變化。基于此，計算機輔助的模式識別和專家分析系統已經成功被用于解釋在多種毒理學實驗狀態下獲得的NMR數據（Gartlandet al. 1991, Holmeset al. 1992, 1994, 1998a, b, Anthonyet al. 1994, Spraulet al. 1997, Beckwith-Hallet al. 1998）。這些統計學工具與目前在基因組學和蛋白質組學研究中使用的方法非常相似。最簡單的方法就是將NMR信號強度數據看作代謝物濃度或者分泌速率的多樣品矩陣。現階段沒有必要進行譜圖歸屬，因為只是將它作為統計對象來處理。
模式識別通常是指在數學上減低多參數維度來進行科學假設和假設檢驗的一種數據分析方法，主成份分析就是其中最簡單的一種。主成份是由多個原始變量經過加權后進行線性組合生成的新的變量。主成份有如下特征：（1）每個主成份之間相互正交；（2）第一主成份包含最多的數據方差信息，其它依次遞減。因此，前兩個或者三個主成份就代表了數據中所含的主要的生化信息的改變，這樣的主成份圖可以用于藥物和毒素在不同器官中根據其毒理學機制聚類分析的可視化（Nicholson and Wilson 1989, Gartlandet al. 1991）。主成份分析不需要提前對樣品進行分組，是一種非監督的分析方法，有時候聚類信息也可能在較小的主成份中體現。使用這種簡單的代謝組學方法我們可以將來自于未知毒性化合物處理后的動物樣品與NMR產生的代謝數據進行比較，進而確定它在模式識別圖中的相似擬合度（Holmeset al. 1998a, b）。
Figure 2. (a)不同毒素處理后的大鼠尿液譜圖主成份分析得分圖。(b) Cooman殘差圖
然而在真實情況下，毒理學數據會更為復雜，因為病變的發展和自愈過程是實時變化的。因此，NMR檢測的代謝輪廓是隨時間變化的（Holmeset al. 1992, Beckwith-Hallet al. 1998）。另外，在原始多維NMR代謝組空間比較外源化合物的效應會更為嚴格。作為一種可選和自動化毒性分類方法，NMR數據的監督分析已經被證明是有效的。監督模式下的數據分析，首先使用NMR代謝組學數據（稱為訓練集/training set）來構建一個數學模型可以準確預測每個樣品的分類。接下來使用獨立數據對根據訓練集所建的計算模型的預測能力進行檢驗。這些模型也被人們稱為專家系統，它們可以包括不同的數學程序，比如主成份、人工神經網絡和規則歸納法等。所有情況下這些方法都允許定量描述多變量邊界用以區分不同外源化合物的代謝效應。某些監督分析方法，比如SIMICA可以估算擬合相似性的可信度，使用類似的方法可以將樣品歸屬為某一特定類型、多種類型的毒性或者不分類。
目前我們研究組構建的代謝組學專家系統主要具備以下三個不同水平的病理生理特征:
1）根據使用對照組數據建立起來的代謝組標準對樣品進行二元分類（正常和異常）。
2）根據毒性和組織內發揮毒性的位置對靶器官進行分類。
3）鑒定所研究化合物毒理效應的生物標志物和毒性機制分類。
非常有趣的是，這些水平的分類也適用于基因組學和蛋白質組學研究，甚至臨床診斷篩選過程。隨著毒理學數據庫數量的不斷增長以及快速高通量NMR采樣技術的提高，有必要采用像“模糊邏輯”類似的方法建立更精妙的專家系統，以滿足分組之間邊界決定更好的靈活性要求。上述代謝組學方法使開發專家系統原型用于在第一和第二水平對一系列毒理學終點事件和靶器官進行分類成為可能。第三水平的分類會有更為復雜的問題，具體的生物標志物信息可以從主成份載荷圖中獲取（Holmeset al. 1998b）。
總而言之，大量的生化、毒理學和臨床化學問題可以使用高分辨率1H-NMR波譜技術分析生物樣品來解決。目前簡單的生物體液1H-NMR實驗就可以為整個生命體的生化過程和毒理學生物標志物的種屬差異提供意想不到的見解。隨著儀器設備和技術的發展，代謝組學的應用越來越廣泛。計算機輔助的模式識別和專家系統數據分析對促進基于NMR的代謝研究起到了至關重要的作用。代謝組學研究適用的其他重要領域包括基因修飾導致的生化改變、環境污染物的影響、藥物治療和效果的臨床評估和特異質毒性等。最后，可以預見在不久的將來，可以整合基因組學、蛋白質組學和代謝組學數據形成更全面的生物組系統來整體評價體內功能紊亂。
筆者注釋
在科學實驗研究中，大家通常把大規模檢測生物樣品中的多種代謝物水平的研究都稱為代謝組學研究。也有人把代謝組學分為非靶向代謝組學、靶向代謝組學及擬靶向代謝組學等，這些概念對理解檢測分析方法的異同點會有幫助，但是其本身對科學研究的貢獻其實并沒有本質區別。研究人員可以根據具體的實驗目的靈活選擇。筆者更傾向于將代謝組學理解為結合儀器分析和化學計量學方法來同時研究多個小分子代謝物在生物樣品中實時變化水平的方法技術學科。
