重磅綜述丨Phenomics阿爾茨海默癥進展
《表型組學》（Phenomics）以封面論文在線發表了美國威斯康星大學麥迪遜分校李靈軍教授課題組題為Recent Advances in Understanding of Alzheimer’s Disease Progression Through Mass Spectrometry-Based Metabolomics的綜述文章。論文DOI鏈接：https://doi.org/10.1007/s43657-021-00036-9。
阿爾茨海默癥（Alzheimer’s disease，AD）是老年人群出現癡呆的主要原因，它給國家和社會經濟帶來的負擔越來越重。因此，阿爾茨海默癥早期診斷尤為重要，其最大挑戰在于在更嚴重的、不可逆的癥狀出現之前診斷出處于臨床前階段的個體。
篩選生物標志物對于準確診斷阿爾茨海默癥患者至關重要。一個可靠的生物標志物必須顯示出可測量的變化，協助區分健康人和患者。當然，最好能在疾病進展的輕度認知障礙（mild cognitive impairment, MCI）階段就區分出健康人與阿爾茨海默癥患者。傳統的生物標志物發現通常來源于蛋白質（蛋白質組學）或基因（基因組學）研究，而代謝組研究可以揭示患者表型，包括遺傳因素和環境影響。由于代謝組學可以測量特定時間存在的代謝物，故能揭示患者隨時間變化的生理狀態及其對特定刺激的動態反應。
很顯然，患者的腦組織不是生物標志物篩選的可行樣本來源；因此，早期研究使用死后的腦組織作為阿爾茨海默癥生物標志物來源；現在，研究者們開始轉向關注循環體液中的潛在樣本對象。質譜（MS）是一種強大的、無標簽的技術，可用于代謝物的鑒定和定量。該篇綜述討論了基于質譜（MS）的阿爾茨海默癥代謝組學研究，包括樣品類型和制備、質譜數據采集策略和數據分析以及從研究中獲得的生物學見解，希望為未來的阿爾茨海默癥代謝組學研究提供參考。
實驗設計
患者篩選
患者招募和選擇對任何疾病的研究都是至關重要的，但由于阿爾茨海默癥在患者死后才能明確診斷，因此，阿爾茨海默癥研究的患者選擇存在不確定性。在該綜述中，所提及的多項研究所采用的阿爾茨海默癥診斷標準各不相同，例如美國國家老齡化研究所-阿爾茨海默氏癥協會（NIA-AA）的標準、美國國家神經和交際障礙疾病及中風研究所和阿爾茨海默氏癥及相關疾病協會（NINCDS-ADRDA）頒發的標準以及《精神疾病診斷與統計手冊》第四版（DSM-IV）所采用的不同標準等。
其中，NIA-AA標準承認使用生物標志物作為診斷手段的潛力，該標準認可的阿爾茨海默癥診斷生物標志物包括成像和生化生物標志物，可分為三類：聚集的β-淀粉樣蛋白（Aβ）、聚集的tau（神經纖維纏結）以及神經退行/神經元損傷（表1）。
樣本類型
阿爾茨海默癥生物標志物的代謝組學研究可以選擇多種不同類型的樣本。腦脊液（Cerebrospinal Fluid，CSF）是最廣泛使用的體液之一，但收集CSF是一個侵入性的過程且必須由醫生來完成，這使得難以將該體液用于大規模篩選。
此外，血漿也是阿爾茨海默癥研究的樣本來源之一。相對CSF采集，血漿獲取更便捷，且能相對準確地代表整個身體系統。然而，由于血腦屏障的存在，血液代謝情況可能難以反映大腦的代謝情況。此外，一些研究表明，血漿代謝情況會因性別、年齡和種族等因素而異。目前，諸多研究將血漿與其他類型樣本結合使用（圖2）。血清和血漿密切相關，血清的整體代謝物濃度較高，但在不同樣本間的定量和重現性相比血漿較差。
尿液因其具有非侵入性、無菌且易收集的特點，也可作為生物標志物的來源。但尿液主要含有親水性代謝物，其脂類和其他非極性代謝物的濃度較低；而脂質代謝失調卻是阿爾茨海默癥研究關注內容之一，因而尿液可能不是阿爾茨海默癥生物標志物的合適來源樣本。
唾液是最容易獲得的體液之一。但阿爾茨海默癥經常導致患者唾液流量減少和口干，這使得很難收集到足夠的樣本進行分析。
樣本收集與準備
代謝組的樣本收集與準備主要分為三個部分：空腹采樣、萃取和衍生化。
空腹采血是多種血液測試的標準做法，因為消化過程可能會提高某些代謝物和營養物質的水平，如葡萄糖和甘油三酯。也有研究卻表明，空腹時一些代謝物的濃度與非空腹時的濃度沒有顯著差別。該綜述中有9項研究要求受試者在樣本采集前禁食，2項不要求禁食（樣本為血漿），另有4項沒有說明。
萃取溶劑的選擇決定了哪些代謝物將被提取出來從而進行分析。理想溶劑可以提取到所有的代謝物并將其降解到最小分子質量。萃取一般可以分為兩類：單相萃取和雙相萃取。單相萃取法使用單一溶劑將代謝物萃取到一個相中，操作簡單，有很大優勢。該綜述包括了9項利用單相萃取的研究，其中7項使用了乙腈。此外，甲醇也常被用作單相萃取溶劑。雙相萃取法則利用溶劑組合將代謝物萃取到極性或非極性相中，溶劑組合通常為水加一種有機溶劑。雙相萃取可以獲得更高的代謝組覆蓋度，且雙相溶劑組合可利用互補分離的方法進行代謝組研究。因此，雙相萃取法屬于國際代謝組研究中最常用的方法。當然，雙相萃取也有一些缺點，即在處理許多雙相溶劑組合時，耗時長且技術難度大。
分析物的化學衍生化對于進一步檢測至關重要，通過衍生化可以改變代謝物的結構、分子極性和大小。衍生化也可以用來穩定待分析物分子，一般來說，氣相色譜法（GC-MS）需要衍生化來增加待分析物的熱/化學穩定性和揮發性。GC-MS中的衍生化也可以通過改變待分析物的分子特性（如極性）來提高分離效果。常用的衍生化包括硅烷化、肟化、烷基化和�；�。該綜述中的大多數研究使用了無標簽的方法，但實際上，同位素標簽已被廣泛應用在標記官能團、定量代謝物等方面。
質譜數據的采集
質譜數據采集的過程主要包括分子分離、電離、質量分析。
該篇綜述中介紹了多種分離方法，包括反相液相色譜（RPLC）、親水作用色譜（HILIC）、LC-MS、GC-MS等。其中，RPLC能夠覆蓋人類代謝組的非極性和半極性部分，但極性代謝物在C18柱上的保留率很低，并且會因洗脫太快而無法分離和檢測。HILIC根據分子的親水性進行分離，疏水性的代謝物會較早被洗脫，而親水性的、典型的極性代謝物被很好地保留。HILIC是對RPLC的補充，經常被正交使用，以確保在非靶向實驗中完全覆蓋阿爾茨海默癥代謝組（圖3）。
LC-MS、GC-MS也常被用在代謝組實驗中，但不是所有的代謝物都能被揮發或熱穩定到足以用于GC-MS。此外，毛細管電泳（CE）是一種極具成本效益的分離方法，它需要的樣品量很小，并且最適用于極性和帶電代謝物的分離，這使其成為RPLC的補充方法。離子遷移光譜-質譜（IMS-MS）也是一種獨特的分離和識別代謝物的方法。上述所有的分離技術都是在電離前分離代謝物，而IMS-MS則是利用緩沖氣體來分離電離后的分子。
電噴霧電離（electrospray ionization，ESI）因能廣泛覆蓋分子而成為代謝組學的首選技術。ESI在正極性（ESI+）和負極性（ESI-）模式下操作：容易被質子化的分子（堿）在ESI+中更容易被檢測到，而可以去質子化的分子（酸）在ESI-中更容易被檢測到。
代謝組的研究可分為靶向或非靶向兩大類，靶向的目的是對已經確定分析物的特定代謝物進行定量，而非靶向代謝組研究尋求更大的代謝組覆蓋率，并旨在通過高分辨率來區分具有相似質量的分子。為了在質量分辨率較低的情況下增加代謝物鑒定的可靠性，可以使用串聯質譜（MS/MS）。該綜述中涉及的大多數研究都采用MS/MS進行實驗。
數據分析和生物信息學方法
靶向代謝組學研究通常有一個較小的分析物范圍，這使得加入內參便能實現絕對定量。該綜述中包括的一些研究利用穩定的同位素標準進行絕對定量，但大多數研究使用有質控的相對定量和變化倍數計算。在靶向研究中針對大規模代謝物進行量化的前景十分明朗，多反應監測（multiple reaction monitoring，MRM）和平行反應監測（parallel reaction monitoring，PRM）等技術正力圖提供實現大規模靶向代謝組學量化的途徑。
數據預處理是代謝組學研究中的一個重要步驟，包括去卷積和特征檢測等步驟，還包括空白校正和歸一化等質量控制步驟。盡管存在一些商業軟件包，如Compound Discoverer™和MetaboScape®，但這些僅適用于特定質譜儀器的數據分析。目前逐漸流行的是將原始數據文件轉換為與開源軟件包（如MS-DIAL、XCMS）兼容的開放格式。
在該綜述提及的研究中，根據其統計分析思路可分為兩類：將代謝物濃度與公認的生物標志物（如Aβ）相關聯，以及將代謝物濃度與是否存在阿爾茨海默癥癡呆癥狀相關聯。前者可能更有利于檢測到重要生物標志物，因為代謝物濃度的變化可能更容易與淀粉樣蛋白聚集物的增加而不是感知到的認知變化等相關（圖4）。
生物學見解
該綜述包括了15項不同的阿爾茨海默癥代謝組學研究，并且各自都使用了不同的體液樣本。通過比較從各種分離方法及質譜技術中所得到的發現，可以確定研究結果的一致性如何。通過多種體液之間的比較，不僅可以顯示出多個系統之間的相似性，還可以闡明不同體液之間的關系。該綜述整合討論了這些研究數據，并對幾個重要的代謝途徑進行了詳細分析。
能量代謝
研究發現在一些體液中能夠檢測到與能量有關的代謝物。該文總結了一些相關的關鍵特征：阿爾茨海默癥患者的大腦通常顯示出葡萄糖代謝水平明顯下降；阿爾茨海默癥患者的能量代謝失調還表現為胰島素抵抗和大腦中胰島素的低表達；山梨醇濃度的增加表明葡萄糖-山梨醇途徑在阿爾茨海默癥患者中可能被激活；3-羥基丁酸在阿爾茨海默癥患者尿液中持續減少等等。
氨基酸代謝
阿爾茨海默癥患者體內，精氨酸在CSF和血漿中表達量減少，提示由于精氨酸酶和一氧化氮（NO）合成酶之間的相互作用，使得精氨酸酶的表達可能有所增加。一氧化氮是維持大腦功能的關鍵，可調節腦血流，并作為一種神經遞質發揮作用。如果沒有精氨酸酶表達量的變化，精氨酸的減少也可歸因于精氨酸轉向代謝為胍基化合物。已知的許多胍基化合物具有神經毒性，從而會增加氧化應激反應。
異亮氨酸、亮氨酸和纈氨酸是被稱為支鏈氨基酸（branched chain amino acids , BCAA）的三種必需氨基酸。該綜述所提及的研究中，與對照組相比，阿爾茨海默癥患者體內三種BCAAs表達量均有所下降。體內BCAAs濃度的降低可能導致谷氨酸的產生減少，導致大腦中谷氨酸能神經元的損失。纈氨酸在楓糖尿病患者體內的高濃度與細胞凋亡的增加有關。纈氨酸濃度降低可能是阿爾茨海默癥患者的身體對體內細胞凋亡進程增加所作出的反應。
此外，血液中同型半胱氨酸的異常積累也與阿爾茨海默癥發展的高風險有關。高同型半胱氨酸水平與區域性腦萎縮和血管病變有關，可能影響tau蛋白的磷酸化和膽堿酯酶的降解。
膽堿代謝
阿爾茨海默癥早期發展的病理事件包括基底前腦的膽堿能神經元損失。乙酰膽堿是一種能夠參與膽堿能神經元系統（包括運動神經元和參與記憶的神經元）活動的基本神經遞質。
乙酰膽堿是由膽堿乙酰轉移酶（choline acetyltransferase, ChAT）產生的，這種酶在阿爾茨海默癥患者大腦中的活性明顯降低，其活性降低程度與認知障礙的嚴重程度相關。多項研究檢測發現阿爾茨海默癥患者的膽堿濃度增加，這可能是由于ChAT的活性下降引起的。盡管目前尚無可逆轉阿爾茨海默癥發展的藥物治療手段，膽堿酯酶抑制劑通常被用于暫時改善阿爾茨海默癥患者的一些認知癥狀。
脂肪酸代謝
相關研究檢測到幾個與肉堿有關的代謝物出現了明顯的改變，表明阿爾茨海默癥患者的脂肪酸代謝發生紊亂。中鏈�；鈮A在阿爾茨海默癥患者血漿中明顯減少，并與衡量認知表現的小型精神狀態檢查（mini-mental state examination, MMSE）得分有高度相關性。此外，研究發現阿爾茨海默癥患者血漿中花生四烯酸的減少及其前體亞油酸的增加。亞油酸和花生四烯酸都被證明可以誘導tau和Aβ的聚合，這意味著它們可能關聯并甚至誘發了阿爾茨海默癥的一些病理變化。
總結與展望
阿爾茨海默癥是一種非常復雜的疾病，絕非僅由一種代謝功能紊亂所導致，本綜述中的研究闡述了阿爾茨海默癥的相關代謝紊亂，后續逐漸統一的阿爾茨海默癥相關研究將有利于探尋更加明確的受影響通路。
阿爾茨海默癥研究應建立更加統一的患者隊列標準，并增加患者隊列的多樣性。此外，阿爾茨海默癥研究設計的一致性也應該擴展到相關的實驗方法中。對于潛在的阿爾茨海默癥生物標志物而言，它需要持續失調并不斷地出現在阿爾茨海默癥代謝研究中。
文中討論的每種樣本類型都具有優勢和劣勢，而通過唾液和尿液的非侵入式的樣本收集對基于生物標志物的阿爾茨海默癥診斷需謹慎考慮。盡管收集尿液或唾液可以減緩對患者的創傷，且具有很強的便利性，但因阿爾茨海默癥患者經常出現神經精神性癥狀和精神病性癥狀，應用上述兩種方法仍需十分謹慎。盡管如此，任何可從患者輕松收集到的樣本都將大大減少患者和護理人員的壓力。
隨著更多研究的深入開展，可以配合使用許多潛在的代謝生物標志物和與目前公認的蛋白質生物標志物相結合，以便在疾病的早期階段更加準確地診斷阿爾茨海默癥。
Abstract
Alzheimer’s disease (AD) is the leading cause of dementia in the aging population, but despite extensive research, there is no consensus on the biological cause of AD. While AD research is dominated by protein/peptide-centric research based on the amyloid hypothesis, a theory that designates dysfunction in beta-amyloid production, accumulation, or disposal as the primary cause of AD, many studies focus on metabolomics as a means of understanding the biological processes behind AD progression. In this review, we discuss mass spectrometry (MS)-based AD metabolomics studies, including sample type and preparation, mass spectrometry data acquisition strategies, and data analysis, as well as biological insights gleaned from these studies, with the hope of informing future AD metabolomic studies.
作者簡介
Lingjun Li（李靈軍）教授，2002年加入美國威斯康星大學麥迪遜分校，致力于生物分析科學以及質譜相關技術的研究，主要涉及的領域有神經肽組學、蛋白質組學、代謝組學等，并應用這些尖端的分析方法和技術去解決神經生物學、基礎和臨床醫學中的關鍵性問題。
文章轉自微信公眾號人類表型組計劃。
