文獻分享丨JPR三甲胺和氧化三甲胺的生物學功能追溯
2022年3月，澳大利亞莫道克大學的Jeremy K. Nicholson和Elain Holmes團隊在Journal of Proteome Research上發表了綜述文章“Balancing the Equation: A Natural History of Trimethylamine and Trimethylamine- N-oxide”，總結了TMA和TMAO的檢測分析方法以及其在系統生物學中的重要功能。
三甲胺（Trimethylamine, TMA）和它的氮氧化物氧化三甲胺（TMAO）廣泛存在于生物界和自然環境中，具有重要的生物學功能，比如細胞信號轉導等。血清和尿液中的TMAO作為心血管疾病的危險因素已經引起越來越多的重視，然而這只是TMA/TMAO在眾多生物過程中發揮作用中的冰山一角。
1、生物學中的甲胺
甲胺在生物界中廣泛存在，由原核生物和真核生物通過特定的代謝通路合成，一部分甲胺也可以通過非生物過程合成 （Figure 1）。甲胺的廣泛存在也預示著其在演化生物學中的重要作用。本綜述相對全面地總結了TMA和TMAO的生物學功能，主要強調了其對人類生理和病理過程的影響。可以從頭合成TMA的微生物廣泛存在于多個生態系統中，包括海洋沉積物、淡水和海水中的藻類群落和哺乳動物的腸道。腸道中TMA主要來源是膽堿和甜菜堿的微生物降解或者由食物中的TMAO被腸道微生物還原產生。
Figure 1. (A) Overview of an abiotic formation of methylamine and (B) the four main microbial pathways of TMA metabolism including methanogenesis (green), anaerobic TMA dehydrogenase (pale blue), and aerobic TMA oxidation (brown) and acetogenesis (black).
由于TMA和TMAO與動脈粥樣硬化的發展相關，因此目前受到了大量關注，而它們的其他生物學功能則很少被提起，多年前的有關TMA的古老文獻大多被遺忘。Chhibber-Goel等人的綜述詳細總結了一些鮮為人知的有關TMA的研究歷史。雖然化學結構上TMA和TMAO有相關性，但是它們卻具有不同的物理化學性質和生物學功能。TMA通常被認為是信息素或者化學信號劑；取決于細胞所處的化學環境，TMAO既可以保護細胞也可以破壞細胞。TMA最顯著的特性就是強烈的魚腥味，鑒于此，它在很的物種中既可以充當化學引誘劑又可以充當驅避劑。在大多數脊椎動物中，TMA在肝臟黃素單加氧酶3（FMO3）作用下生成沒有氣味的TMAO。TMAO在一些魚類中可以作為滲透劑行使功能，防止尿素和其他變性作用對細胞蛋白功能的影響，在一些海洋生物和脊椎動物中，TMAO可以充當滲透壓、低溫和高靜水壓力刺激的保護劑。然而，有關TMAO穩定蛋白的機制仍然存在爭議。基于紅外研究和分子動力學模擬，TMAO具有通過增強水的氫鍵相互作用來削弱肽-水相互作用的功能。詳細的有關TMA和TMAO生物學功能的總結見Figure 2.
Figure 2. Summary of exemplar biological functions of TMA and TMAO on various prokaryotic and eukaryotic organisms.
2、甲胺的分析測量
三甲胺TMA最早由Hofmann在1852年正式分離和鑒定出來。與其他胺類物質相似，TMA具有強烈的刺激性氣味。TMA的有機/水分配系數很低（氯仿 logP 0.54）；pKa 為9.8；密度為空氣的兩倍。由于其密度較高，所以在產生TMA的生物周圍具有持久的氣味。TMA的沸點較低（3 ℃），蒸氣壓較高（25 ℃時為1610 mmHg ）。TMA可以由有機物、污水和食物殘渣（特別是來自食品漁業工業）分解產生，所以其在環境中廣泛存在。早在1900年就發現人體組織和體液，比如尿液、血液、糞便、膽汁和精液中也存在TMA。與此同時，發展了大量的生物樣品中甲胺及其相關化合物（膽堿、甜菜堿等）的檢測方法。環境中的TMA和其他甲胺類物質的檢測也使用類似的方法。光譜學技術包括NMR、LC-MS和GC-MS是使用最為廣泛的方法。很多LC-MS方法采用多反應監測（MRM）模式選擇性地檢測特定類型的甲胺類物質。TMAO和TMA的檢測通常可以采用高通量模式完成，因為其樣品制備過程簡單，分析時間較短（GC-MS除外，因為其需要化學衍生化）。TMAO在尿液和血液中相對穩定，多次凍融并不會顯著影響其濃度。
3、TMA和TMAO在細菌中的生物學功能
TMA和TMAO可以作為大量生活在海洋、淡水和哺乳動物腸道中細菌的營養物質。甲胺類物質與細菌的關系可以使用基因組技術來研究，可以鑒定出細菌中能夠合成或者代謝TMA/TMAO的基因，或者將TMA/TMAO濃度與細菌的類別和種屬做相關分析。
3.1海洋和淡水細菌中的TMA代謝
在海洋環境中，特別是來自于SAR11和Roseobacter進化枝的異養細菌能夠產生TMA以及氧化TMA。SAR11 α變形菌門為海洋中豐度最高的異養微生物，它的基因組相對較小（1308759 bp），編碼了一碳化合物和帶有甲基基團化合物，比如甲醇、甲醛、甲胺、甜菜堿、TMA、TMAO和二甲基磺基丙酸酯的氧化途徑相關酶。因此，TMA和TMAO是海洋中氮碳循環的重要組成部分。
TMAO為細菌厭氧呼吸的底物，在細菌將TMAO還原成TMA時作為呼吸傳遞鏈的末端電子受體。將TMAO還原成TMA也是細菌的特征性代謝。西太平洋深海沉積物中屬于γ變形菌門的海洋細菌Shewanella在厭氧生長時使用TMAO、硝酸鹽和硫酸二甲酯作為電子受體。
宏基因組分析海洋沉積物發現主要有三種酶參與將TMAO還原成TMA， 它們分別是膽堿-TMA裂解酶（CutC; 主要存在于厭氧海洋沉積物）、TMAO還原酶（TorA; 主要存在于海洋沉積物和開放海域）和甘氨酸甜菜堿還原酶（GrdH; 低豐度）。微生物代謝TMA的四條通路包括乙酸生成、甲烷生成、脫氫和有氧氧化，因此在海洋環境中，TMA代謝的主要產物是乙酸、甲烷、氨和甲醛（Figure 1B）。
細菌的酶要適應其所在的環境條件。比如，靜水壓力增大會導致海洋細菌TMAO還原酶活性增強，這與適應深海環境中高濃度的TMAO相符。Lidbury等發現在一些海洋細菌中，TMAO的吸收需要特異性的轉運體，并且鑒定了一個獨特的三磷酸腺苷結合轉運體（TmoXWV）。
3.2 哺乳動物中TMA和TMAO的代謝
在哺乳動物中，腸道細菌將食物中的膽堿和肉堿轉換成TMA。Falony等已經詳細地總結了與TMA產生相關的腸道細菌的基因和種屬，與海洋中產生TMA的細菌具有很多相似之處（Figure 1）。在哺乳動物中能夠產生TMA的腸道細菌基因包括CutC、肉堿單加氧酶（CntA/B）和GrdH。與海洋環境類似，TMAO還原酶通路在人的腸道中最活躍，主要來自于變形菌門中的克雷伯氏菌和大腸桿菌屬，而CutC和GrdH主要來自于厚壁菌門。
腸桿菌科的某些成員也可以將TMAO逆向轉化成TMA，在TMAO的循環中也起了重要作用。糞便體外發酵研究表明TMA和雙歧桿菌、梭狀芽胞桿菌和球形菌相關，因此腸道中TMAO可以促進腸桿菌屬的生長。
在人體中，肉食和雜食者比素食者生成TMA和TMAO的能力要強，這與觀察所得的食草動物體內不存在產生TMA的細菌酶CntA/B或者低表達CutC以及循環中TMAO水平較低一致。食物中添加肉堿會導致血漿TMAO濃度升高，但是此效應可以被抗生素攝入所抵消，進一步表明微生物在將肉堿代謝成TMA和TMAO過程中的重要作用。大量研究也表明無菌和抗生素抑制的嚙齒動物不能產生TMAO。無菌大鼠暴露于正常實驗環境后，尿液中TMAO濃度逐漸上升，在大約21天后達到穩態。在傳統小鼠模型中，補充肉堿可以導致循環系統中TMA和TMAO升高，同時也導致糞便中Anaeroplasma、Prevotella和 Mucispirillum豐度升高。然而，補充TMA的前體物質γ-丁甜菜堿與升高的Staphylococcus spp.、Akkermansia、 Parasutterella、Prevotella和Bacteroides豐度相關。微生物與TMA和TMAO產生之間的關系在細胞保護以及心臟代謝和其他慢性疾病中的作用也有很多深入研究。
4、TMAO在海洋和陸地環境中作為滲透劑和細胞保護劑
所有的生物都有應對細胞周圍溶液滲透壓變化的方法。海洋中鹽度的變化、細胞中代謝廢物的累積、高溫和細胞外低溫冷凍都可以導致細胞內水分的凈流出。滲透劑就是細胞內能夠抵抗滲透壓影響的分子。無機離子比如鉀離子或者不穩定溶質比如尿素可以調節水環境，同時也可能破壞細胞中的蛋白。破壞溶質穩定性的滲透劑有乙醇、尿素和精氨酸等，它們與蛋白表面發生相互作用進而降低自由能，利于蛋白形成非折疊態。尿素可以直接與蛋白骨架中的極性基團比如肽鍵相互作用從而使蛋白表面分子間相互作用減弱，破壞蛋白的二級和三級結構。它也可以間接地與溶液環境相互作用，改變疏水分子基團的結構和水的動力學來提高溶劑化能力。大多數生物體通過積累相容性的滲透劑來調節滲透壓，它們通常是不帶電或者兩性有機小分子，通過氫鍵與蛋白的三級結構相互作用來穩定蛋白的結構。溶液穩定型滲透劑通過提升蛋白非折疊狀態的自由能來使蛋白易于形成折疊態。它們被生物體廣泛地用于抵抗破壞性滲透劑導致的不良效應，保護生命體免于脫水、高鹽和極端溫度帶來的傷害。海洋軟體動物、甲殼類動物和魚類在海水的高滲透壓環境中就利用TMAO來調節細胞體積。Yancey等闡明在海洋生物中TMAO是比甘氨酸甜菜堿和甘油更好的滲透劑。在一些海洋生物中，比如甲殼類動物和某些鰓類動物，TMAO是主要的滲透調節劑，其濃度可以高達0.2 M。在哺乳動物和其他生物中，甲胺同樣作為無害性滲透劑和細胞保護劑，其可以積累在腎皮質和髓質中以防止脫水和抵消尿素和其他毒素對腎單位的有害影響。TMAO被認為是腎臟的細胞保護劑，因為它可以逆轉NaCl和尿素高滲透壓導致的茚三酮陽性物質的積累，腎毒素比如溴乙胺和丙烯亞胺等的攝入會導致嚙齒動物腎皮質內TMAO積累，同時尿液中排泄的TMAO降低， 但是在腎髓質中TMAO的濃度通常很低。
雖然有很多研究使用多種方法來研究TMAO穩定蛋白結構的機制，但是其詳細機制仍然有爭議，目前提出的潛在機制主要如下：
1）降低蛋白和水之間氫鍵的強度：
在生理pH值條件下，TMAO是高度親水性的，傾向于與水形成氫鍵。
這增強了水氫鍵網絡的強度從而減弱了水和蛋白極性基團直接氫鍵的作用強度，導致優先排斥蛋白表面的TMAO復合物。
這種氫鍵結構增強的水稱為“冰山水”，使蛋白骨架蛋白的羰基脫水從而不易形成非折疊結構。
在這種情況下，TMAO作為助溶劑，其通過與水相互作用來增加細胞蛋白和水的混溶性，而并不需要直接與蛋白發生相互作用。
除此之外，在不同壓力下的分子模擬和溶解度實驗表明TMAO可以通過減弱水氫鍵和蛋白骨架的相互作用來間接穩定蛋白內氫鍵結構。
2）分子擁擠：
TMAO被蛋白表面排斥，證據為發現蛋白周圍存在水分子擁擠環境，影響了蛋白周圍水分子結構從而穩定蛋白結構。
一項最近的分子動力學研究表明TMAO可以提高脂膜上的液/膠轉換溫度，增強脂分子的排列順序從而導致更大的堆積密度。
3）肽-尿素溶劑效應的改變：
尿素與蛋白骨架相互作用導致蛋白結構展開。
TMAO可以與尿素的氨基直接作用，從而降低尿素與蛋白的相互作用。
實驗已經證明TMAO可以提高溶解溫度，增強熱穩定和增加蛋白展開自由能。
因此，TMAO可以穩定折疊狀態蛋白的結構或者逆轉錯誤折疊和變性的蛋白，比如乳酸脫氫酶。
與以上提出的這些穩定機制不同，Liao等人采用X射線拉曼散射光譜表明其他的滲透劑比TMAO對水結構的影響更強烈。因此，他們推測其機制是TMAO作為折疊蛋白的極性和非極性表面交界處的表面活性劑，而與分子擁擠和氫鍵并沒有關系。
作為細胞保護劑，TMAO以多種方式發揮作用。在海洋環境中，TMAO還可以保護蛋白免于壓力變化導致的變性。比如，硬骨魚肌肉和血漿中TMAO濃度與其生活的深度呈線性相關，暗示TMAO積累與壓力相關。在功能方面，升高的TMAO濃度可以降低靜水壓導致的某些酶的失活，比如乳酸脫氫酶和丙酮酸激酶。滲透劑在哺乳動物腎中的作用與TMAO在海洋生物中作為蛋白穩定劑的作用相似。當腎臟由于脫水、高尿酸和其他毒素濃度導致滲透壓增大時，腎髓質TMAO濃度會增加從而降低酶的解離速度。與此相反，Rani等人發現TMAO可以作為細胞破壞劑。當TMAO處于高濃度時，TMAO可以與蛋白表面甚至整個疏水口袋直接發生相互作用，這會降低蛋白處于展開態的自由能，使平衡向變性方向偏移。
另一個TMAO作為細胞保護劑的例子是其在暴露腎毒素動物的腎組織中累積，提示它可能在組織內積累作為毒素誘導細胞應激的一種響應。在植物界，TMAO在植物中作為滲透保護劑和非生物脅迫誘導基因表達的激活劑，可以提升植物對干旱、高鹽和低溫環境的抵抗能力。TMAO還被證明能促進微管多聚化，其是真核生物中有絲分裂和胞內轉運的必要結構，由微管蛋白和其他蛋白形成的螺旋聚合物組成。甲胺中只有TMAO還可以保護由尿素和低溫刺激導致的微管解聚。如討論所述，TMAO不直接與蛋白相互作用，而是引起氫鍵增加導致蛋白水和化從而降低蛋白的暴露表面積。然而，即使TMAO在腎臟中濃度很高，但是抵抗尿素導致的微管蛋白不穩定的效應不能完全歸于TMAO, 它應該是一個其他非破壞性滲透劑也參與的復合效應。
雖然TMAO的主要作用看起來是細胞保護劑，但是它還有一些其他的用途 （Figure 2），比如一些海洋生物使用TMAO來控制浮力。Withers等人使用分子量和偏摩爾體積計算了血漿和肌肉中的溶質組成，發現TAMO可以提供1.7 g/L的正向升力，密度比大多數溶質比如鈉鉀離子都要低。另外，在盲鰻受到威脅時會排出大量的由五顏六色粘液團來堵塞捕食者的鰓。這些粘液團通過一種粘附作用而不容易分散，因為其含有高濃度的甲胺，其中就有TMAO、二甲基甘氨酸和甜菜堿。
5、TMAO作為細胞破壞劑
雖然像TMAO這樣的滲透劑通常可以穩定蛋白來保護細胞和組織，但是Yancey發現在沒有細胞破壞劑的情況下，穩定蛋白可能會帶來不利影響。因此，“化學伴侶”或者“抵消溶質”的概念比“相容溶質”更加準確。TMAO能夠增強蛋白質和配體結合的穩定性從而抵消很多細胞和組織中的尿素效應，同時它也可以過度穩定失去功能的蛋白聚合物，比如β樣淀粉蛋白。有一些研究表明TMAO既可以作為酶的激活劑也可以作為抑制劑，它也不總是能抵消尿素效應。比如，尿素抑制乙醇脫氫酶、乳酸脫氫酶、黃嘌呤氧化酶和過氧化氫酶；TMAO激活乙醇脫氫酶和乳酸脫氫酶，對黃嘌呤氧化酶有弱抑制作用，增強過氧化氫酶的熱穩定性。這表明TMAO不總是抵抗尿素效應。Mashino等人的研究表明當TMAO選擇性穩定催化循環的基態時，會抑制酶的活性；當TMAO選擇性穩定催化循環的過渡態時，會對酶有激活作用。TMAO對蛋白穩定性的影響部分取決于所處化學環境的pH值。有一些蛋白，比如朊病毒、溶菌酶、核糖核酸酶A和載脂蛋白-α乳白蛋白，TMAO在pH高于其pKa時增強其熱穩定性，低于其pKa時降低其熱穩定性。另外一個決定TMAO對蛋白穩定性影響的因素是蛋白折疊的動力學。Kumari等人的研究表明恢復突變蛋白的折疊發生在快速折疊的蛋白中，比如朊病毒蛋白，但是不會發生在慢折疊蛋白，比如碳酸酐酶、辣根過氧化物酶和膽堿乙酰轉移酶，因為這些蛋白含有很多脯氨酸殘基，TMAO可以穩定中間體并且降低完全折疊蛋白形成的速度。進一步研究表明在碳酸酐酶的慢速重折疊階段，TMAO抑制了脯氨酸殘基的順反異構，這一效應是TMAO特有的，在其他滲透劑中并沒有發現。TMAO處理HeLa細胞會抑制細胞活力，使處于有絲分裂S期的細胞增多。
因此，TMAO與蛋白之間的相互作用比較復雜，有關其對蛋白生理功能的正面和負面的影響均有報道。當閱讀文獻時，必須要清楚體外實驗環境與正常生理環境并不一致，比如物質濃度、pH、溫度，在解釋實驗結果時要加以考慮。
6、TMA的信使功能
TMAO的功能可以寬泛地總結為穩定蛋白，但是TMA的主要功能則是作為化學信號。現有研究已經表明TMA既可以作為化學引誘劑也可以作為化學趨避劑。但是，不同的物種演化出不同的功能，比如信息素的檢測、吸引腐爛的食物來源，或者避免捕食者。雖然痕量胺受體的組織分布并不廣泛，但是作為嗅覺系統的一部分其可以誘導先天的動物行為反應，存在于所有哺乳動物中。TMA對人類和大鼠是趨避劑，但是對小鼠、蒼蠅、蚊子和魚類卻是引誘劑，一些植物則使用TMA對食草動物發出威懾。TMA在各種植物、動物甚至某些真菌的生殖結構中積累，對動物的荷爾蒙和行為模式影響深遠，包括一些兩棲動物和魚類的求偶行為。小鼠尿液TMA的排泄已經演化作為它們行為信號模式的一部分，這也一定程度上解釋了為什么小鼠尿液中TMA的濃度比大鼠的高。TMA在其他哺乳動物比如牛中也作為化學引誘劑，在發情期奶牛的陰道液中的TMA可以引誘公牛的交配行為。小鼠和一些水生生物比如黑頭鰷魚分泌TMA作為一種領土信號分子。蛇分泌的TMA被認為可以防止天敵捕食。
TMA在水中和脂類溶劑中都可溶，因此可以快速擴散分布至全身。除此之外，它可以透過皮膚，在皮膚表面與空氣接觸，形成約2.86 atm的蒸氣壓，使它很容易揮發。但是，因為TMA密度是空氣的兩倍，在空氣中擴散的速度并不快，這就使得分泌TMA的生物可以長期帶有TMA，成為合適的化學信使。
TMA對小鼠的引誘性依賴于痕量胺相關受體5（TAAR5），在TAAR5敲除小鼠中，其引誘效果消失。TAAR5在多個腦區均有表達，預示其除了感受氣味和調節情緒行為還可能 有其他功能。Espinoza等人研究表明TAAR5敲除小鼠不容易焦慮，并且血清素代謝受到影響，表現為海馬中5-羥色胺和5-羥基吲哚乙酸水平降低。
TMAO作為細胞保護劑、TMA作為化學信使的具體生理功能在研究它們對心血管疾病和其他疾病中的貢獻時經常被忽視。在理解TMAO對心血管疾病和其它疾病的影響時，全面了解飲食和血液中濃度變化與正常生理水平和節律的關系至關重要。
7、TMA和TMAO的自然變化和生物節律
體液和組織中TMA和TMAO的濃度以及其在人體內的變化受年齡、性別、激素水平、生物節律、飲食和腸道菌群的影響。在健康成年人中，尿液中TMA和TMAO的濃度也會有變化，大多數研究報道的尿液TMAO濃度在6.8-181.2 μmol/mmol 相對肌酐，比TMA的濃度（0.21-0.98 μmol/mmol 相對肌酐）要高出好多倍，在吃了魚肉后TMAO/TMA的比值還會進一步升高。在尿液中TMA和TMAO隨時間的穩定性方面，Li等人發現樣品在-20℃放置30天并不會有任何變化，反復凍融5次也不會影響TMA和TMAO的濃度。健康的西方飲食人群空腹血漿中TMAO濃度為3.4-4.5 mM, 在12個月內相對穩定，不會受飲食、生活方式或者是日常生化分析影響。盡管腸道菌群與TMAO相關，但有關正常糞便中TMA和TMAO的濃度信息還不清楚。Fiori等人報道在兩個健康志愿者中，TMA的糞便濃度為0.080-0.146 μmol/g, TMAO的濃度為0.015-0.058 μmol/g。
7.1 年齡
人類與腸道微生物在演化過程中共同發展，與TMA/TMAO合成的關系非常明顯，這些化學物的濃度會隨著年齡變化。TMA和TMAO 的產生主要由微生物將飲食中的膽堿轉化而來，大量研究表明抗生素處理會顯著降低尿液和血漿中的TMAO含量。TMAO會由嬰兒的尿液中排出，濃度會在三到四歲時逐漸下降，提示早期嬰兒的腸道微生物可以處理母乳中含量較高的膽堿。一項研究表明早產兒TMAO、牛磺酸和肌醇對肌酐的平均比值比足月兒分別高14.1、4.3和10.1倍，提示TMAO可能作為滲透劑來平衡腎單位生理發育的不完全。
在成年人中，尿液中TMAO會隨著年齡增加。一項研究表明，小于45歲的健康成年人TMAO和二甲胺的平均濃度分別為62.5 ± 59.0 mmol/mol 相對肌酐和34.0 ± 6.5 mmol/mol 相對肌酐，大于45歲組分別為81.5 ± 66.8 mmol/mol肌酐和40.5 ± 10.6 mmol/mol肌酐。因為FMO3的表達豐度并不受年齡影響，所以年齡和TMAO和TMA排泄的增加之間的相關性很可能反應了隨著年齡的增長腎過濾系統的效率下降或者與年齡相關腸道微生物的改變從而影響TMA的產生。
7.2 性別和激素的影響
尿液中TMAO和TMA的濃度在不同性別動物之間具有顯著差異。在脊椎動物中，TMA在雄性動物的尿液中更高。一個可能的解釋是TMAO作為一種信息素發揮功能。與此不同，TMAO的濃度在雌性大鼠、小鼠和人類中更高。這一發現與女性肝臟中FMO3的表達豐度更高一致。然而也有研究表明TMAO的分泌不受性別影響。激素對性別差異導致的TMAO和TMA濃度不同的影響還不清楚，但是在人類中發現TMAO水平在月經和更年期更高，雌性大鼠發情期TMAO濃度也較高。相反在男性群體，睪酮的水平與FMO3表達成負相關，這可能是在男性中TMA與TMAO的比值偏高的原因。
懷孕期間孕婦的血液和尿液中TMAO水平的升高也進一步提示激素影響TMAO和TMA。血液中TMAO升高與先兆子癇、全身炎癥、內皮功能障礙和血清脂多糖增加相關，這與腸道微生物和腸道屏障完整性的改變一致。血漿TMAO的水平和妊娠糖尿病的關系還存有爭議，而TMA的水平與不良妊娠事件包括妊娠糖尿病和胎兒發育遲緩相關。雖然TMA與胎兒生長之間的相關性重復性不好，但是在動物模型中比較清楚，給懷孕小鼠攝入0.75 mM TMA導致胚胎發育減緩約30%，并且73%的胚胎具有神經管發育缺陷。通常情況下，當在培養的胚胎中加入乙胺時，會看到明顯的毒性效應，比如胚胎存活、大小以及DNA和RNA含量均有不良影響，TMA、DMA和單甲胺（MMA）毒性依次降低。
7.3 種族
雖然有關不同人群體液中TMA和TMAO濃度差異的報道，但是這些差異更多的是由飲食差異導致的，與種族本身關系不大。比如，瑞典和日本人的尿液中TMAO濃度比英國人要高，主要是因為他們吃了更多的魚肉。
7.4 晝夜節律
一些證據表明TMAO和TMA的排泄受晝夜節律影響。在小鼠模型中，早晨收集的樣品中TMA濃度較高，而TMAO濃度則比較低。在人類中，血液中TMAO濃度晚上比早上要高。睡眠剝奪也會導致尿液中TMAO和其他微生物相關代謝物濃度升高。
8、 飲食與TMAO濃度的相關性
TMA和TMAO的主要飲食來源前體物質是膽堿和肉堿，三甲基賴氨酸和麥角硫氨酸對飲食中的TMA也有少量貢獻（Figure 2）。尿液和血漿中甲胺濃度均可以反應飲食攝取的魚肉、紅肉、雞蛋、奶制品、豆制品、豆類和一些綠葉蔬菜。但是在考慮飲食對血液和分泌TMAO的影響時，應該要清楚不同飲食之間的比較非常困難，因為缺少將不同飲食來源TMAO標準化的方法，比如具體食用了哪種魚類以及采樣的時間點等。飲食干預后個體間的TMAO差異可以高達10倍，這表明除了腎功能和FMO3基因多態性，腸道微生物的組成在個體間存在較大差異。
海魚的攝入對尿液和血漿中TMA和TMAO的濃度具有強烈的影響，并且與魚的TMAO含量和種類以及環境都有關系。攝食后TMAO可以升高4.72-50倍，TMA也類似。血漿甲胺濃度在進食15分鐘后開始上升，2小時后達到峰值，高水平的甲胺濃度至少可以保持6小時。第二大TMAO飲食來源是肉制品，尤其諸如牛肉等紅肉，其含有豐富的肉堿。Wang等人發現空腹尿液和血漿中TMAO濃度在攝取紅肉4周后會升高，而同等熱量的白肉或者植物蛋白對TMAO水平則無明顯影響，這與血液中TMA和TMAO與心血管疾病風險增加相關一致。直接在飲食中添加1.5 g/天劑量的肉堿，持續24周后會導致血漿中TMA濃度升高10倍，但是這與炎性標志物，比如C反應蛋白、腫瘤壞死因子α或者白介素6的變化無關。
飲食中蛋類和奶制品也可以提供少量的膽堿和肉堿，但是比魚肉和紅肉要少的多。有關奶制品對TMA/TMAO水平的影響結果并不一致。一個研究發現攝食奶制品與血漿TMAO濃度正相關，而另一個研究則報道攝入奶制品后餐后血漿和尿液TMAO水平降低。這些研究也從側面表明比較飲食研究結果的困難，因為方法、研究人群和樣品采集很難做到協調一致。與奶制品類似，蛋類攝入對TMAO濃度的影響，有些研究發現其可以提高血液和尿液中TMAO的濃度，而有些研究則沒有發現顯著差別。為數不多的研究表明素食食物中抗性淀粉與血液中TMAO濃度升高相關。
全膳食對全身和排泄TMAO水平影響的詳細評估表明高蛋白飲食可以導致TMAO水平升高，與魚肉和紅肉相關研究一致。一些研究也表明，雜食動物的尿液和血漿中TMAO含量比素食主義者要高。高脂飲食對TMAO的影響結果頗具爭議，僅有一項報道在5天的干預期內，血液中TMA濃度僅在進餐后的4小時有一過性升高。有研究表明減肥飲食可以降低血漿中TMAO濃度，一項研究表明血清TMAO濃度降低與膽堿TMA-裂解酶編碼屬，比如瘤胃球菌屬、副擬桿菌屬和擬桿菌屬相關。但是，如果不考慮飲食中膽堿和肉醬含量的影響，很難從上述實驗中得到可靠的結論。
9、疾病狀態和紊亂
血液和尿液中TMAO和TMA的濃度與多種病理狀況直接正相關，包括心血管疾病、糖尿病、癌癥、自身免疫性疾病、多囊性卵巢綜合征和自閉癥；與其他疾病比如癡呆和炎癥性腸病負相關。但是，有關這些疾病的文獻結果并不一致，反映了人體與腸道微生物相互作用的復雜性。研究最多的與TMAO相關的慢性病包括心血管疾病、糖尿病和腎病，尤其是血漿TMAO濃度和心血管疾病風險直接的關系。TMAO在心血管疾病發生中的作用仍然存有爭議，雖然絕大多數研究認為TMAO和心血管疾病的發生有因果關系，但是一些研究組提議TMAO在人類病理中的作用需要更加全面和綜合的考量。TMA/TMAO與心血管疾病方面的研究已經有比較全面的綜述，我們在此只簡要的總結一下TMAO和TMA與各種疾病的關系，主要關注在原核生物和動物界保守的代謝，重點強調細菌通過TMA和TMAO代謝介導的對哺乳動物病理過程。
9.1 魚腥味綜合征（原發性三甲胺尿癥）和一過性三甲胺尿
尿液、汗液和呼吸時分泌過多的TMA會導致身體有腐爛的魚一樣的味道，被稱為原發性三甲胺尿癥（TMAU, OMIM 602079）。這種代謝紊亂由Humbert在 1970年發現，由FMO3突變導致，FMO3突變使得TMA被氧化成TMAO的活性降低。目前已經有超過40個突變會嚴重降低FMO3的活性。這種病的診斷主要通過遺傳篩選和測量TMAO/TMA比值，一個人如果TMA/(TMA+TMAO)的比值大于10%很可能得了魚腥味綜合征。TMUA患者的TMA水平通常會升高300倍，而TMAO水平也會有輕微升高。
英國白人雜合子的攜帶率為0.5-1.0%，其他人群攜帶率可能更高。TMUA的癥狀通常在出生時就出現了，在青春期和女性月經期會加重。雖然TMUA沒有身體上的不適，但是難聞的氣味可能導致心理和社會問題。TMUA病人攝入的TMA，70%會以原型排出。雖然抗生素治療和核黃素補充劑可以用于降低TMA水平，但是目前TMUA患者主要通過飲食限制TMA和TMA前體物質，包括膽堿、卵磷脂和TMAO來治療，同時建議病人少吃牛奶、雞蛋、肝臟、腎臟、豆類、蕓苔屬植物和魚以及海鮮類食物。
9.2 心臟代謝疾病和腸道菌群的作用
9.2.1. 心血管疾病
TMAO已被確立為心血管疾病的危險因素和病因之一，在多篇綜述中都有所介紹。總的來說，血液中TMAO的濃度與心力衰竭、心肌梗塞、心臟性腎病死亡率、外周動脈疾病和中風相關，并獨立于其他傳統危險因素。其中一些研究表明血液中TMAO的濃度與下游死亡率相關。兩個大的隊列分析，共收錄了超過一萬名參與者，發現血漿TMAO濃度升高使不良心血管事件發生率升高23-58%，全因死亡率增加55%。
目前，關于TMAO與動脈粥樣硬化發展的潛在機制有兩個假設：第一個是TMAO可以作為疾病的標志物，反映心血管疾病和動脈粥樣硬化性腎動脈狹窄，因為它們導致尿液中TMAO降低，同時伴有血漿中濃度升高；第二個是TMAO在疾病發展中起到了決定性作用，因為它可以促進泡沫細胞的累積，從而抑制膽固醇反向轉運，影響膽汁酸和固醇代謝導致血小板活性升高來促進動脈粥樣硬化斑塊形成。作為支持這一因果關系的證據，Zhu等人發現直接將血小板暴露于TMAO可以增強刺激依賴性血小板激活。腸道菌群在TMAO與心血管疾病發生的因果關系中起了至關重要的作用，因為TMAO的產生依賴于腸道微生物將飲食來源的膽堿和磷脂酰膽堿轉化成TMA。無菌小鼠不用利用飲食來源產生TMAO，也不會形成動脈硬化粥樣斑塊。與此相似，通過口服抗生素來抑制腸道菌群既可以抑制TMAO的產生也可以抑制動脈粥樣硬化斑塊的形成。將高具有濃度血漿TMAO的促血栓形成小鼠的腸道菌群移植給無菌小鼠也導致被移植小鼠血液中TMAO水平升高，血栓形成的可能性增大。
TMAO可以通過促進NLRP3炎性體來影響血管炎癥，導致炎性細胞因子白介素1β和白介素18的釋放，抑制一氧化氮的產生。這進一步強調了腸道菌群在TMAO促進心血管疾病中的重要作用。但是，也有一些研究發現血漿TMAO與炎性標志物比如C反應蛋白并無相關性。轉錄因子FoxO1是代謝疾病的重要驅動因子，可以結合內質網應激激酶PERK。TMAO可以誘導FoxO1表達，通過腸道菌群來降低TMAO水平可以降低PERK激活和肝臟FoxO1水平，進一步表明宿主與腸道菌群相互作用的重要性。
顯然，TMAO參與動脈粥樣硬化形成，涉及飲食、微生物和宿主信號傳導過程之間的復雜相互作用。飲食作為血液中TMAO的來源已經被廣泛討論過，與越來越多的證據表明TMAO與冠心病直接相關相反，攝入富含TMAO的魚肉長期以來一直被認為與降低心血管疾病風險相關。一些研究報道TMAO的前體物比如肉堿、膽堿或者甜菜堿與主要心血管事件相關，同時也有報道并沒有發現相關性，另外還有研究表明心血管疾病危險因素主要是TMA介導的，而不是TMAO。例如，在大鼠模型中，TMA可以導致平均動脈血壓升高，而TMAO則沒有任何影響。已經有綜述文章指出了關于TMAO和它在心血管疾病中作用的理論并不一致。Ufanl等人認為TMAO和心血管疾病的關聯在于對心臟功能不全導致的心臟和腎臟靜水壓和滲透壓升高的補償反應。
9.2.2. 肥胖
肥胖是心血管疾病和2型糖尿病的危險因素，炎癥在病程發展過程中起了重要作用。很多研究報道了體重指數與血液中TMAO的濃度存在相關，但是也有陰性結果的報道。血清中TMAO與衡量肥胖的其他標準，比如臟器肥胖指數和脂肪肝指數相關，而尿液中TMA則直接與肥胖相關。
幾乎沒有研究在排除混雜因素比如飲食影響的健康人群中研究BMI和TMA/TMAO的關系。動物模型是常用的替代研究對象，用來幫助我們理解肥胖-腸道微生物-炎癥軸，但是產生的結果喜憂參半。ob/ob肥胖小鼠尿液中TMA水平比對照組要低，db/db肥胖小鼠模型結果也類似。這一結果與在人群中發現的TMA與肥胖程正相關相反。血清和尿液中TMAO水平在Zucker大鼠肥胖/糖尿病模型和肥胖豬模型中均降低。更進一步，在高脂飲食誘導的小鼠肥胖模型中，飲食添加TMAO可以顯著降低動脈粥樣硬化指數。
因為肥胖是糖尿病和心血管疾病的最大危險因素，所以從代謝改善以及后續炎癥反應降低和促進代謝健康等方面對減肥策略進行了評估。一系列飲食干預和減肥試驗已經表明減肥與降低血液中TMAO和心血管疾病風險以及內臟脂肪相關。雖然Lin等發現血清中TMAO水平與骨礦物質密度呈負相關，但是Zhou等人發現TMAO可以保護減肥時骨礦物質密度降低，這與飲食類型無關，提示TMAO可能具有預防骨質疏松的作用。當考慮TMA/TMAO在減肥中這些不一致的結果時，需要清楚很多發表的減肥研究并沒有考慮飲食中的TMAO，而涉及長期給予TMA前體的研究通常劑量都超過正常飲食或者治療補充劑中的劑量，從而導致TMAO在心臟代謝疾病中的作用并不明確。
當飲食和運動減肥失敗后，減肥手術是一種治療個體病態肥胖的策略。減肥手術的重要特點之一是腸道微生物組成和代謝在術后都會發生顯著變化，通常在體重減輕之前就發生了。大鼠進行胃繞道手術后，糞便中升高的甲胺（MMA和TMA）濃度與糞漿的細胞毒性正相關。在人和動物減肥手術研究中有一項觀察到的結果比較一致，就是術后TMAO排泄增加，這與以厚壁菌門和擬桿菌們為主的腸道菌群向伽馬變形桿菌轉變有關，尤其是腸桿菌科。這也與腸桿菌是產生TMA的主要細菌相符合。雖然有血液中TMAO與冠心病相關的假設，但是減肥手術可以降低冠心病風險，看起來TMAO的故事很復雜，千頭萬緒。
9.2.3. 2型糖尿病
胰島素抵抗和2型糖尿病與血液中TMAO升高相關。血清中TMAO水平與糖尿病病程、腸道通透性標志物、脂多糖內毒素和產生TMA的細菌均相關，TMAO誘導的脂肪組織炎癥破壞胰島素信號通路被認為是背后的可能機制。對于糖尿病患者，TMAO是心血管事件發生的高危險因素標志物。在高脂飲食小鼠模型中，0.2%TMAO處理3周引起空腹胰島素水平升高，糖耐量加重，促炎因子MCP-1升高，抗炎因子白介素10降低。
9.3. 腎病
多種不同腎病，包括慢性腎病（CKD）、間質性腎炎和腎乳頭壞死，都可以導致尿液和血液中TMAO異常。尿毒癥是指通常經過腎臟排泄的溶質在腎細胞和組織中累積，對內源性分子功能產生不利影響。TMA以及其他甲胺類物質，包括TMAO、DMA、二甲基甘氨酸和MMA，都被歸入尿毒癥毒素。血液中TMAO水平過高提示尿毒癥，但是過低也可能意味著其他類型的腎功能受損。Gessner等人發現腎小球濾過率每升高1 mL/min，血漿logTMAO值降低0.005（0.3%）。
CKD是全世界增長第二快的導致死亡的病因，同時也是心血管疾病的主要危險因素。研究發現血液透析病人的血清TMAO濃度比正常人高10-20倍。CKD病人血液中TMAO濃度為~30 μmol/L，與血清肌酐和尿素含量正相關。腎透析是腎衰竭病人去除腎毒素的主要方法，透析后血液中TMA和TMAO的濃度會降低，但是仍然比正常人要高。與非透析人不同，透析病人血漿TMAO濃度并不能預測住院和全因死亡率，提示盡管血液中TMAO水平比正常人高好幾倍，但是CKD導致的血管內皮損傷程度掩蓋了心血管疾病的結果。與透析相似，腎移植成功后，血漿TMAO水平回歸正常。CKD通常伴有腸道菌群異常，表現為腸桿菌、鹵單胞菌、假單胞菌、莫拉菌和短桿菌豐度升高，乳桿菌和普氏菌降低。這其中的很多細菌與TMA產生相關。尿液中TMA和DMA排泄是腎小球腎病的特征。因為TMAO在腎細胞中作為滲透劑，所以腎臟損傷會導致TMAO水平發生顯著改變。例如，在大鼠腎移植 缺血性腎再灌注損傷，腎功能受損導致血漿中TMAO濃度升高3-5倍，而單側輸尿管梗阻性腎間質纖維化與血清中高濃度TMAO相關，發展到后期TMAO水平則相對比較低。尿液中TMAO升高與腎皮質或髓質細胞損傷直接相關，而尿液排泄TMAO過低也可能提示非甾體類抗炎藥物如消炎痛引起的腎乳頭壞死。
9.4．癌癥
癌癥是全球人類最重要的死亡病因之一，其病因與遺傳和環境因素包括飲食、肥胖、環境污染物、壓力和腸道微生物都有關系。有關腸道微生物與癌癥風險之間的關系，文獻報道的結果基本一致，通常癌癥病人尿液TMAO水平降低。比如，乳腺癌和肝細胞肝癌病人的尿液中TMAO水平均降低。移植人胃腺癌的小鼠，其尿液中TMAO濃度在植入后五天明顯下降，而TMA水平則升高。抗癌藥阿霉素處理可以恢復TMAO和TMA的水平。
血液中TMAO水平與癌癥之間的關系取決于癌癥類型。低血清TMAO濃度見于鼻咽癌和腎細胞癌患者，腎切除后水平升高。與此相反，血液中TMAO濃度在原發性肝癌、口腔鱗狀細胞癌和結直腸癌患者則較高。對于胰腺癌病人，有兩項研究發現了相反的結果，一個發現病人血清TMAO降低，另一個則發現其濃度升高。
TMAO和癌癥之間關系的機制還不清楚。體外實驗表明TMAO可以通過激活TXNIP-NLRP3炎癥信號通路來刺激細胞產生活性氧。TMAO也可以通過保護蛋白折疊或者糾正突變蛋白的折疊錯誤來抑制癌癥發生。與上述假設相反，TMAO被發現可以破壞α酪蛋白功能，而α酪蛋白是蛋白伴侶和腫瘤抑制因子，可以幫助對抗乳腺癌。對于胰腺癌、肝癌和結直腸癌，腸道菌群在疾病病理過程中起了重要作用，這三種癌癥都引起腸道微生物紊亂。
在腦腫瘤和腎癌中，腫瘤組織內具有高濃度的TMAO和山梨糖醇。特別是膠質腦瘤中，TMA可以作為腫瘤生長的標志物，在高級別腫瘤中TMA濃度比低級別腫瘤高。雖然一些體內NMR研究認為TMA是潛在的癌癥生物標志物，但是有時候報道的化學位移看起來更像是TMAO。
當考慮甲胺在癌癥中的作用時，甲胺的直接毒性效應不能被忽略。有人提出，膳食中高濃度的胺和酰胺，比如TMAO，可以被轉化成TMA和DMA， 而后兩者是致癌物二甲基亞硝胺的前體物質。因此，含有高濃度甲胺的海鮮（比如魷魚、鯊魚和鱈魚等）以及發酵的豆制品所含的DMA和TMA可能在體內形成N-亞硝基化合物。因為富含膽堿和肉堿的食物（比如紅肉）可以被代謝成TMAO，所以TMAO與結腸癌相關也并不奇怪。大多數研究得到的證據并不充分，因此系統地研究TMA/TMAO水平與癌癥類型和分級的臨床診斷之間的關系非常有必要。
10 、結論
演化壓力導致TMA和TMAO在多種水生和陸生生物中廣泛存在。非生物過程和原核以及真核生物產生的甲胺在生物界無處不在，并發揮重要功能，提示這些簡單的化合物參與演化早期基礎的化學和生理過程。雖然TMAO直接依賴于細菌產生的TMA，但是二者生物學功能并不相同。TMAO主要功能是蛋白質穩定劑或者破壞劑，而TMA則是一種信號素或者荷爾蒙信號。
最近TMAO已經被歸為心臟代謝疾病的不利因素，一些實驗表明其是潛在的病因，但是也有一些結果在不同實驗中并不一致。將TMAO和TMA完全歸為有害分子是不合適的，毫無疑問二者具有重要的生理功能。與很多生化系統類似，分布模式和濃度最終決定了總體的物理效應。TMAO和TMA的代謝起源來于腸道微生物，腸道微生物與人類宿主共同演化，然而大量研究評估TMAO濃度時并沒有考慮它的微生物代謝前體TMA。其他現有研究的缺陷是沒有考慮飲食對TMAO產生的貢獻，并且一些實驗在檢測前已經將TMA變成TMAO。還有很多常見的有違直覺的現象無法解釋，比如為什么日本人飲食中含有大量的TMAO，但是他們心血管疾病的發病率并不高；為什么減肥手術可以降低心血管疾病發生率，但是顯著增加TMAO的排泄。
TMAO和TMA在多個不同演化尺度的生物系統中發揮復雜的功能，直覺上告訴我們它們是大多數生命形式所必需的。它們的調控基于廣泛而復雜的遺傳和環境因素相互作用，表明很有必要在系統水平深入研究TMAO和TMA的化學和生物性質。盡管如此，TMAO/TMA代謝異常與大量人類疾病相關，了解這些過程可能是理解各種疾病病理的基礎。
