文獻分享丨Nat Protoc代謝組學非靶流程
代謝組學是繼基因組學和蛋白質組學之后新興發展起來的學科，是系統生物學的重要組成部分。代謝組學的概念來源于代謝組，代謝組是指某一生物或細胞在一特定生理時期內所有的小分子代謝產物，代謝組學則是對某一生物或細胞在一特定生理時期內所有小分子代謝產物同時進行定性和定量分析。色譜-質譜平臺經常用于對單個生物液體或組織樣本中的數百至數千種代謝物進行高靈敏且可重復的檢測。
英國曼徹斯特大學Royston Goodacre團隊聯合人類血清代謝組學聯合會（HUSERMET）對基于質譜技術的大規模血清/血漿代謝組學研究的實驗流程進行了詳細描述，相關研究成果于2011年7月發表于Nature Protocols，文章標題“Procedures for large-scale metabolic profiling of serum and plasma using gas chromatography and liquid chromatography coupled to mass spectrometry”。原文鏈接：https://doi.org/10.1038/nprot.2011.335。
代謝組學是系統生物學研究的核心組成，主要是對小分子量有機和無機（<1500 Da）代謝產物的整體研究。與其他“組學”平臺（例如轉錄組學或蛋白質組學）相比，代謝物分析能夠以高通量方法和較低的總成本對大樣本集進行全局篩選。代謝組學分析平臺包括氣相色譜（GC）或液相色譜（LC/UPLC）聯用質譜（MS）、毛細管電泳、核磁共振光譜、紅外和拉曼光譜、電化學檢測器，或直接使用MS等檢測。由于哺乳動物代謝組的復雜性，沒有一個單獨的分析平臺可以用于檢測生物樣本中的所有代謝物，必須使用多個分析平臺來提高檢測代謝物的覆蓋率。GC-MS或UPLC-MS由于高通量、高精密度及低成本而廣泛應用于代謝組學研究。
血清/血漿的大規模代謝組學研究
在臨床代謝組學研究中，涉及的樣本包括血液（血清、血漿）、尿液、腦脊液、淋巴液、膽汁、糞便、唾液、細胞、組織等，其中血液（血清、血漿）是研究最多的樣本。血液在生物體內有著廣泛的流動性，起著最重要的物質傳輸作用，包含數百或數千種代謝物，可以反應生物體最直接、最有效代謝情況。
人類的代謝表型受到了遺傳因素和環境（飲食、年齡、生活方式、性別等因素）的影響。為準確有效地定義其代謝變化，需要大樣本量的流行病學調查，可能涉及數千個樣本（比如隊列研究）。核磁共振方法由于重現性極高，樣品不與儀器直接接觸，具有非破壞性的優點，容易實現對數百到數千個樣本的高通量分析。對于色譜-質譜平臺來說，由于樣品注入到分析器中，會污染儀器，存在響應差異和保留時間漂移，諸多因素限制了高分辨質譜的通量。因此，基于色譜-質譜平臺，進行大規模代謝組學實驗時，必須使用代表性質控樣本（QC），保證數據的穩定及可重復性。代謝組學大規模研究中的通用工作流程包括：實驗設計、樣品制備、數據采集、數據預處理、多實驗數據集成/數據分析。
實驗設計
在實際研究中，代謝物易受各種因素影響。代謝組學的研究從小規模擴展到大規模，即從單次分析樣本少于100個的生物實驗擴展到數月或數年內分析數千個樣本。規模擴大后需要合理選擇參與者（研究設計）、生物樣本的收集、分析實驗的設計（實驗設計），以使后續的數據分析無偏向且符合目的。
在大規模的隊列研究中，由于色譜-質譜系統中，代謝特征（儀器信號響應）會隨著時間變化，因此，在整個分析過程中定期分析QC樣品，以便為檢測到的每個代謝特征提供可靠的質量保證（QA）。在后期數據處理階段，可以通過QC校正每個樣本的代謝信號，并在數據采集后和統計分析前將批量數據合并在一起。
1）樣本收集與保存：血清是不加抗凝劑通過凝血和離心除去血細胞和纖維蛋白原后分離得到的上清，而血漿是從全血中通過加入抗凝劑后離心分離得到的。關于抗凝劑選擇，檸檬酸鹽和EDTA都可能引入干擾峰或抑制內源性分析物而影響代謝譜，因此，在收集血漿樣品時首選肝素鋰。制備血清和血漿后，分裝儲存在-80℃，避免反復凍融。
2）GC-MS應用：主要用于分析揮發性化合物或可以通過衍生化轉變為揮發性的化合物。GC主要可以實現分子量范圍為18-350 Da的代謝物分離，包括氨基酸、有機酸、胺、酰胺和糖等。GC-MS代謝分析常用的質譜儀為飛行時間（TOF）和四極桿質譜。樣品在GC中的保留時間（常用保留指數）與經質譜EI離子源產生的特征碎片，可以幫助比對數據庫進行代謝物鑒定。血清和血漿中發現的許多代謝物在GC-MS分析之前需要衍生，常用的衍生化方法是三甲基硅烷化（TMS）。
3）UPLC-MS應用：UPLC是超高效液相色譜，具有高分離度和高靈敏度等，常與TOF或傅立葉變換/軌道質譜儀聯用。UPLC-MS的線性動態范圍超過三到五個數量級，可以檢測到濃度低于最高濃度0.01%的代謝物。常用的色譜分離法為反相色譜法，溶劑通常為甲醇或乙腈。質譜常用的離子源為電噴霧離子源（ESI），為提高代謝物覆蓋率，一般進樣時采用兩種模式，正離子模式（ESI+）和負離子模式（ESI-）。UPLC-MS可以檢測的代謝物較為廣泛，包括大分子量范圍（50~1500Da）代謝物，如高分子量脂質（如磷脂和甘油三酯）和非極性氨基酸。與GC-MS相比，UPLC-MS的樣品制備較簡單，不需要衍生，常用蛋白沉淀法。
4）血清/血漿樣本的選擇：血清和血漿中的代謝物種類差異不大，但并不完全相同。血漿和血清從血液中去除細胞的方法將導致產生的液體成分略有不同。血漿或血清的選擇一般基于環境、設施及個人偏好。鑒于血漿和血清之間的樣本成分可能存在差異，應注意確保在任何特定研究中僅使用一種樣本類型。
血清/血漿樣本前處理
血清或血漿樣本中包括小分子代謝物和其他高分子量物質（包括蛋白質和RNA），基質較復雜。基于GC/UPLC-MS研究的血清和血漿樣品，需要經過前處理后才可進樣分析。常用的方法為蛋白沉淀，即添加有機溶劑或溶劑混合物以沉淀蛋白質等高分子量物質，然后通過離心分離沉淀物和含有代謝物的上清液。常用的沉淀劑為甲醇，比例為3:1（體積/體積）時可高效去除蛋白質，且步驟簡單。此外，因血清和血漿含有高水平的酶，為抑制酶活性，減少對代謝物的影響，蛋白質沉淀時應使用冰溶劑或步驟在冰上進行。與UPLC-MS相比，用于GC-MS進樣分析的前處理需要衍生化，步驟較多，且進樣體積小（通常為1µl），容易產生誤差。通常在所有樣品中加入一個或多個內標物，用于校正樣品處理和進樣時的誤差。
樣本分析（數據采集）
如上所述，基于GC/UPLC-MS的樣本量較小的實驗，可獲得重復且穩定的數據，通過質量保證程序處理多個小規模的分析實驗數據，整合成為大規模代謝組實驗。作者通過對GC-MS和UPLC-MS方法優化和驗證后，單個分析實驗的樣本量宜為120個樣本。此外，在GC-MS和UPLC-M的每個分析批次結束時需進行儀器維護，包括質譜儀離子源和色譜柱清洗等。
在大規模血清樣本分析時，QC樣本的選擇及穩定可保證整個實驗的準確。QC樣本需與樣本種類保持一致，其代謝和基質組成與研究中的生物樣品相似。一般有兩種QC樣品，一種是混合QC，是將待研究的每個生物樣品的一部分混合后制備，一種是商業QC樣本。混合QC最接近研究樣本，適合樣本量較小的實驗研究，但是不適用大規模研究。作者在血清大規模分析時，發現商用血清QC與研究樣本之間存在代謝物及其相對濃度不同的情況，會丟失部分代謝信息。因此，作者建議使用來自所有受試者群體或受試者群體子集的混合QC樣本，以確保最小程度的代謝信息丟失。
使用QC樣品的原因，首先是在分析樣本前可用QC平衡儀器響應、分析方法，以確保獲得可再現的數據；其次是用QC提供分析數據來計算每個分析區塊內的技術精度，即QA程序。對于UPLC-MS，分析時三分之二的質控樣品中檢測到的代謝物響應在質控平均值的20%以內，而對GC-MS，30%也可接受；第三個原因是使用QC樣本來校正分析批次內及批次間的信號校正。可采用本地散點平滑估計（Locally Estimated Scatterplot Smoothing，LOESS）方法用QC進行信號校正（QC-RLSC）。即通過QC樣本中相同代謝特征的信號變化，來校正周圍研究樣本中每個代謝特征的信號漂移。為使信號校正準確，要求在每3-5個樣本中插入QC樣本。
數據處理
使用GC-MS和UPLC-MS采集的原始數據通常需經過預處理，以適當的格式提供結構化數據用于數據分析。使用一系列軟件處理這些數據，以構建色譜峰（具有相關保留時間或指數、EI碎片質譜和/或準確質量）、峰值響應與對應樣品的矩陣。這數據轉化可在儀器公司自建軟件中進行，如Waters MarkerLynx、ThermoFisher SIEVE、Agilent MasshHunter、Applied Biosystems MarkerView、Shimadzu Profiler AM+和LECO ChromaTOF，或在一些開源和免費軟件（如XCMS89、MZmine90、Metalign91和MathDAMP92）中進行轉化。
質量控制
在使用GC-MS和UPLC-MS分析時，信號強度隨時間漂移的問題是長期代謝組學研究中的一個挑戰。在進行數據分析時，色譜反卷積處理后，需要使用QC-RLSC將每個檢測到的代謝特征歸一化。使用QC樣本進行QA、信號校正和數據集成的數據預處理工作流程如下圖所示。詳細的方法可以參考原文。
代謝物鑒定
代謝組學非靶分析中，代謝產物鑒定是最大的難題。目前，在色譜質譜采集數據的代謝組學數據集中，由于鑒定的數據庫還不完善，還存在很多未識別的色譜峰。人體代謝組由內源代謝產物、外源代謝產物（例如藥物、食物成分、植物化學物質）、內源和外源代謝產物的代謝產物以及來自腸道菌群的代謝產物組成，而并非所有已知的代謝物都可以購買來構建質譜庫以幫助識別。一般代謝物的鑒定包括以下方法：
1）推定鑒定，將代謝特征的單個參數（如準確的質量或質譜碎片）與數據庫中的代謝物進行匹配，置信度較低。
2）最終鑒定，在相同分析條件下，比對樣品中存在的代謝物與標準品的兩個或兩個以上參數，進行匹配。
3）使用質譜庫鑒定GC-MS檢測到的代謝物，包括商業數據庫（如NIST/EPA /NIH）、免費數據庫（如Golm Metabolite Database）或實驗室自建庫。樣本衍生代謝物的裂解質譜與文庫中的裂解質譜相匹配，并以匹配概率評分。
4）基于UPLC-MS方法，代謝物的鑒定主要是根據實際得到的譜圖和數據庫中（如HMDB（http://www.HMDB.ca/）、KEGG（http://www.genome.jp/KEGG/）、ChemSpider（http://www.ChemSpider.com/）的譜圖進行比對，根據其匹配程度獲得鑒定結果。然而同一個代謝物在不同儀器平臺上獲得的圖譜是不同的；同一個儀器平臺上，不同分析條件下獲得的圖譜也不同等，這些都限制了代謝物的準確鑒定。
結論
文章描述了血清/血漿樣品大規模代謝組學非靶分析過程中，包括樣品制備、數據采集、數據預處理、信號校正和數據集整合過程等，如下圖所示。這為代謝組學非靶大規模研究提供了標準的操作規程，有助于人類的代謝組學研究發展。
