文獻分享丨Nat Med腸道菌群可干預肥胖
在我國，糖尿病、心腦血管疾病等慢性代謝性疾病的患病率逐年攀升。肥胖與超重是導致慢性代謝紊亂的主要病因。減肥日益成為大眾廣泛關心的健康問題，如何能夠找到安全有效的減肥靶點是目前亟待解決的科學問題。腸道菌群與人類多種疾病的發生密切相關。西方人群研究表明，肥胖人群存在腸道菌群結構失調，細菌多樣性下降，然而在菌種水平導致肥胖發生的細菌仍所知甚少，中國肥胖人群腸道菌群特征又如何？如何影響人體代謝水平？是否可以利用腸道共生菌開發減肥藥物？
上海交通大學醫學院附屬瑞金醫院王衛慶教授團隊以中國漢族青少年為研究對象，首次揭示中國肥胖人群的腸道菌群組成，發現一個能抑制肥胖的腸道微生物-多形擬桿菌（Bacteroides thetaiotaomicron），并闡述了其對代謝物氨基酸水平的影響，該研究成果以“Gut microbiome and serum metabolome alterations in obesity and after weight-loss intervention”（肥胖及減肥干預后腸道菌群和血清代謝物改變）為題于2017年6月19日在線發表在Nature Medicine上。原文鏈接：https://doi.org/10.1038/nm.4358。
研究思路
在青少年肥胖-正常體重人群隊列（GOCY研究）中選擇樣本，開展腸道菌群宏基因組測序并進行深度解析，首次揭示中國青少年肥胖的腸道菌群組成，發現一系列豐度顯著異于正常人群的腸道共生菌，其中多形擬桿菌豐度在肥胖人群明顯下降，進一步通過代謝組學分析血清代謝物水平，發現肥胖人群中谷氨酸的含量顯著高于正常體重人群，并且其含量與多形擬桿菌數量呈反比。進一步通過小鼠灌胃實驗研究證明多形擬桿菌能夠降低降低小鼠血清谷氨酸濃度，增加脂肪細胞的脂肪分解和脂肪酸氧化過程，從而降低脂肪堆積，延緩體重增長速度、降低肥胖度。為了進一步證明多形擬桿菌在減肥獲益中的作用，研究團隊進一步分析了接受減重手術（袖狀胃切除術）的肥胖患者手術前后的腸道菌群改變，發現肥胖患者腸道內下降的多形擬桿菌在減重手術3月后即明顯升高，恢復至正常體重人群水平，同時，術后血清谷氨酸水平亦明顯下降至接近正常體重人群水平。這些研究結果提示，多形擬桿菌水平的恢復可能有助于肥胖患者的減重過程。
通過元基因組關聯研究確定肥胖相關基因和分類學改變
我們對257個糞便樣本進行了鳥槍定序法分析（第一隊列中來自72個肥胖個體和79個瘦對照的151個樣本，第二隊列中來自23個肥胖個體和26個對照的49個樣本，以及來自23個肥胖個體的63個樣本，包括6個接受sg的病例組）。我們發現這些年輕、肥胖的個體的基因計數和細菌多樣性低于對照組（圖1a-c），表明肥胖方面的基因豐富度較低而與種族或年齡無關。還觀察到肥胖微生物組的β多樣性較高，表明肥胖個體的群落結構比瘦對照組更為異質（圖1d）。使用宏基因組關聯分析，使用全基因組關聯分析，我們確定了350524個與肥胖相關的基因（P<0.01，Wilcoxon秩-總和測試，FDR=0.047）。關聯分析也顯示P肥胖相關基因顯著富集的價值分布具有低P值的標記，表明這些基因與肥胖有關。我們確定了一個由MLG組成的細菌群落，多形擬桿菌、單形、卵形類桿菌、類桿菌，在瘦的對照組中顯著富集（圖1e）。
圖1正常體重人群（左）和肥胖人群（右）的腸道菌群組成差異
腸道微生物種類與臨床指標的相關性
為了確定臨床參數與肥胖患者腸道微生物組變化之間的相關性，我們進行了排列方差分析（PERMANOVA）。我們發現BMI和27個代謝參數，包括HbA1c、胰島素抵抗穩態模型評估（HOMA-IR）、血脂濃度、炎癥因子和脂肪因子，與腸道微生物組的改變相關（調整后P<0.05；）。在151名受試者的測試集中，26名MLG與BMI表現出最佳擬合（偽R2=0.59），在另外49名受試者的測試集中保持穩定（偽R2=0.36）（圖2a）。在最適合BMI的富含對照的MLG中，美洲雙歧桿菌、腸雙歧桿菌和卵形雙歧桿菌的MLG排名最高（圖2a）。與受試者測試集中的肥胖個體相比，這些物種在對照組中也高度富集。
瘦素和脂聯素是兩種脂肪細胞衍生的激素，腸道微生物群定植后循環瘦素濃度增加。結果發現，普氏擬青霉和擬青霉微粒與循環瘦素濃度呈負相關，與循環脂聯素濃度呈正相關。D. longicatena與循環瘦素濃度呈正相關，與循環脂聯素濃度呈負相關（隨機森林回歸和Spearman相關值<-0.3或>0.3；圖2b），表明這些物種可能構成連接腸道微生物群和代謝狀態的潛在生物標記物。
圖2腸道微生物種類與臨床指標的相關性
肥胖微生物群落的功能特征
我們確定了至少六個樣本中存在的5705個京都基因和基因組百科全書（KEGG）直系同源物（KO），其中584個KO在瘦和肥胖受試者之間的豐度不同（P<0.01）。
1）腸道微生物種類與宿主循環代謝產物的關系
為了研究肥胖漢族人群中改變的微生物組與宿主循環代謝產物的關系，我們對病例和對照組的血清進行了非靶向代謝組學分析。與對照組相比，肥胖個體表現出明顯的代謝改變。我們確定了148種代謝物，這些代謝物在病例和對照組之間的豐度不同，這使得病例和對照組能夠明確分離。在一組單獨的病例和對照組中，驗證了148種代謝物對病例和對照組的區分。其中，從結構上確定了13種代謝物，包括谷氨酸、苯丙氨酸和酪氨酸。氨基酸的靶向代謝組學分析進一步證實了瘦型和肥胖型個體之間豐度的差異。總的來說，34種氨基酸中20種的血清濃度在肥胖個體和瘦對照組之間存在顯著差異。為了進一步研究循環代謝物豐度的改變是否與腸道微生物群的改變相關，我們使用共慣性分析（CIA）發現217個MLG和148個代謝物之間的共變異，這些代謝物在病例和對照組之間豐度不同。在典型對應分析（CCA）中，酪氨酸、苯丙氨酸、谷氨酸和支鏈氨基酸的載體上清楚地分離了酪氨酸富集型和對照富集型MLG，表明這些氨基酸與肥胖中改變的微生物群密切相關。這些氨基酸與類桿菌的種類呈負相關，包括類桿菌、腸桿菌、卵形桿菌和均形桿菌（斯皮爾曼相關，調整后P<0.05；圖3a）。據報道，大葉雙歧桿菌和卵形雙歧桿菌能夠發酵AAA產生苯乙酸。綜上所述，我們的結果表明，肥胖患者腸道微生物群的改變，特別是類桿菌屬物種的減少，可能與循環中AAA和BCAA濃度較高有關。
在檢測到的氨基酸中，與瘦對照組相比，谷氨酸在肥胖個體中表現出最顯著的增加。谷氨酸與16種富含肥胖的MLG呈正相關，與18種含有編碼谷氨酸代謝相關酶的基因的對照富含MLG呈負相關（圖3a）。值得注意的是，富含肥胖癥的瘤胃球菌（obesitynriched ruminocococus sp.）、D. longicatena和C.comes以及OB-8293，它們擁有編碼從谷氨酰胺中產生谷氨酸所需酶的基因（圖3b），與循環谷氨酸水平正相關，與谷氨酰胺水平負相關。這些觀察結果提示循環中谷氨酸和谷氨酰胺的水平可能反映了這些細菌種類豐度的變化。
此外，血清谷氨酸與多形擬桿菌的豐度呈負相關（圖3a），多形擬桿菌具有編碼谷氨酸脫羧酶的基因（K01580，谷氨酸轉化為GABA；圖3b）。這些結果表明，多形擬桿菌的缺失可能導致肥胖患者血液中谷氨酸濃度升高。此外，血清谷氨酸濃度與肥胖特征呈正相關，如BMI、WHR、waist circumstance,、HOMA-IR、hsCRP和三酰甘油。總之，這些數據表明，腸道微生物種類的氨基酸代謝可能調節與肥胖及其代謝并發癥相關的循環氨基酸水平。
圖3腸道微生物種類與循環氨基酸的關系
2）形擬桿菌對肥胖和宿主代謝的影響
多形擬桿菌是人類腸道中的優勢菌群，它的消耗和肥胖以及血清中的氨基酸濃度相關。基于此，我們研究了腸道中的多形擬桿菌與宿主肥胖之間的可能因果關系。使用未經熱處理的活的多形擬桿菌灌胃，顯著降低常規飼養小鼠的總體和腹股溝脂肪量并增加了瘦組的體重（圖4a-c）。進一步，該措施會減輕高脂肪飲食喂養的小鼠的體重的增加和肥胖（圖4d-f）。與用磷酸鹽緩沖鹽水（PBS）或熱滅活多形擬桿菌灌胃的HFD小鼠相比，用活多形擬桿菌灌胃的HFD小鼠的脂聯素血漿濃度較高，而瘦素血漿濃度較低（圖4g、h）。曾經關于白色脂肪組織的研究表明，給予活的多形擬桿菌比給予PBS（磷酸緩沖鹽水）和未經熱處理的活的多形擬桿菌的脂肪細胞更小（圖4i，j）。此外，與脂肪生成有關的編碼蛋白質的基因（包括Srebf1、Scd1和Fasn）的mRNA水平在灌胃活多形擬桿菌的高脂肪飲食喂養的小鼠的白色脂肪組織中較低，而與脂肪分解和脂肪酸氧化有關的基因（包括Adrb3、Pnpla2、Cpt2、Acox1和Ppargc1a）的表達較高（圖4k）。高脂肪飲食喂養的小鼠脂肪組織中炎癥標記物Cd68、Ccl2、Il6和Il1b的表達因灌胃活的多形擬桿菌而減弱，表明炎癥狀態有所改善（圖4l）。然而，我們觀察到三組的空腹血糖或胰島素濃度及脂肪組織中磷酸化AKT水平沒有顯著差異。喂飼多形擬桿菌對食物攝入和24小時糞便熱量含量均無影響）。值得注意的是，我們檢測到，與用PBS灌胃的高脂肪飲食喂養的小鼠相比，用活的多形擬桿菌灌胃的HFD小鼠的循環氨基酸豐度較低，包括谷氨酸、苯丙氨酸、亮氨酸和纈氨酸（圖4m）。值得注意的是，有報道稱谷氨酸可誘導脂肪分解減少和脂肪細胞增大從而引起肥胖。
16S rDNA擴增子測序顯示，與用PBS或熱滅活多形擬桿菌灌胃的小鼠相比，用活多形擬桿菌灌胃的小鼠的腸道微生物群組成只有輕微變化，并且在厚壁菌的豐度或擬桿菌/厚壁菌的比率方面沒有觀察到差異。值得注意的是，我們觀察到與用PBS灌胃的小鼠相比，用活多形擬桿菌灌胃的小鼠的腸道中多形擬桿菌的豐度要高得多。綜上所述，這些發現表明多形擬桿菌保護小鼠免受飲食誘導的肥胖，并影響循環氨基酸濃度。
圖4多形擬桿菌對肥胖和宿主代謝的影響
3）袖狀胃切除術對腸道微生物和代謝參數的影響
為了進一步研究腸道微生物群、循環氨基酸和臨床表型之間的關系，我們接下來分析了23名肥胖個體在SG后0個月、1個月和3個月的這些參數。體重減輕伴隨著代謝改善。我們使用基于病例對照隊列中MLG相對豐度的隨機森林分類器來區分肥胖個體和瘦個體。使用151個個體的訓練集，我們獲得了接收器工作特性（ROC）曲線（AUC）下的面積為0.9687，使用49個個體的測試集獲得了0.9214。使用與肥胖狀態相關的同一分類器進行的分析表明，SG后肥胖個體的腸道微生物組接近瘦個體（圖5a）。主坐標分析還顯示，0M、1M和3M處的樣本從肥胖菌群轉移到對照組。此外，在SG后3M，腸道微生物組的基因計數和α多樣性顯著增加。1M基因計數的短暫減少可能反映了SG后第一個月的飲食變化。這些數據表明，在SG和體重減輕后，肥胖個體中的微生物組與瘦對照組中的微生物組更為相似。
圖5袖狀胃切除術干預減肥過程中微生物及代謝變化
總結
越來越多的證據表明腸道微生物群作用于肥胖的發展。這項研究結合隊列人群、動物及臨床干預等多層次證據，證明多形擬桿菌有望成為新的益生菌研發靶點，用于減肥藥物或食品研發；該工作為未來針對中國人減肥藥物的研究提供了全新的方向和候選菌株。
