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英國代謝表型協(xié)會推薦：如何評估靶向代謝組學(xué)質(zhì)量
基于LC-MS的靶向代謝組分析被廣泛用于小分子代謝物的檢測。然而，目前業(yè)界還沒有被廣泛接受的標(biāo)準(zhǔn)來確保目標(biāo)代謝物檢測方法的可靠性。近日，來自英國代謝表型協(xié)會的研究人員于2023年5月在Nature protocols雜志上發(fā)表觀點(diǎn)性文章，總結(jié)了歐洲藥品管理局、美國食品和藥品管理局和國際技術(shù)協(xié)會協(xié)調(diào)理事會提供的相關(guān)指導(dǎo)。在此基礎(chǔ)上進(jìn)行綜合和調(diào)整，提出一個(gè)相對簡單的，可用于評估代謝組分析可靠性的“分級方法”，包括發(fā)現(xiàn)、篩選、鑒定和驗(yàn)證四個(gè)方面。考慮了代謝組分析中所遇到的各種問題以及可能的解決方法。原文鏈接：https://doi.org/10.1038/s41596-022-00801-8。
代謝組學(xué)是研究代謝組的一門科學(xué)，而廣義的代謝組包括宿主內(nèi)源性代謝物、外源性小分子物質(zhì)以及微生物來源的代謝物。代謝組學(xué)在系統(tǒng)生物學(xué)研究中起了重要作用，其揭示了從基因到代謝活動的變化，以及基因與環(huán)境之間相關(guān)作用的代謝網(wǎng)絡(luò)。此外，代謝組學(xué)還可以用于生物標(biāo)志物的發(fā)現(xiàn)。
代謝組學(xué)分析方法通常可以分為靶向分析、非靶向分析以及二者相結(jié)合。非靶向代謝組學(xué)是一種以發(fā)現(xiàn)為基礎(chǔ)的方法，其目的是盡可能多的無偏倚地檢測代謝物，然后再將與表型相關(guān)的代謝物（或者叫生物標(biāo)志物）進(jìn)行鑒定。靶向代謝組分析則側(cè)重于分析已知代謝物，其所用方法通常是定量一類代謝物。靶向代謝組學(xué)是以假設(shè)為基礎(chǔ)，由于測量已知代謝物，通常具有較高的靈敏度和選擇性，不足之處是代謝物覆蓋范圍有限。非靶向代謝組學(xué)主要用于產(chǎn)生假設(shè)，具有較大的代謝物覆蓋范圍和生物標(biāo)志物發(fā)現(xiàn)潛力，其不足之處是所檢測代謝物為相對定量，而不是絕對濃度。
用于代謝組分析的主要技術(shù)包括LC-MS、GC-MS和NMR，其中LC-MS使用最為廣泛。靶向方法的難點(diǎn)之一在于獲得合適的內(nèi)標(biāo)。另一方面，靶向檢測的優(yōu)點(diǎn)是目標(biāo)代謝物是已知的，因此對其預(yù)期水平、轉(zhuǎn)化速率以及個(gè)體內(nèi)和個(gè)體間的差異比較了解，有利于分析人員開發(fā)合適的檢測方法來產(chǎn)生可靠的數(shù)據(jù)。然而，由于對新發(fā)現(xiàn)的生物標(biāo)志物知之甚少，方法開發(fā)要重點(diǎn)關(guān)注并行性、選擇性和靈敏度，在稍后檢測階段可以對方法進(jìn)行微調(diào)以滿足檢測要求。
代謝組學(xué)已經(jīng)被用于發(fā)現(xiàn)新的臨床和毒理診斷標(biāo)志物。然而，代謝組學(xué)研究進(jìn)行臨床轉(zhuǎn)化還存在一些挑戰(zhàn)，存在的主要問題包括分析的可重復(fù)性、準(zhǔn)確性、精密度、代謝物的定性和定量、研究設(shè)計(jì)、樣品處理，缺少發(fā)表數(shù)據(jù)的標(biāo)準(zhǔn)化報(bào)告，數(shù)據(jù)的開放獲取不夠，在Biobank中的整合不足，不同批次之間存在變異，不同方法存在偏倚。鑒于上述代謝組學(xué)分析的特點(diǎn)，要評估代謝組學(xué)分析方法的可靠性并不容易。因此有必要定義評估方法可靠度的程度，評估的范圍，以及如何選擇合適的標(biāo)準(zhǔn)和報(bào)告方法。
在本文中，作者提出了評估基于質(zhì)譜的靶向代謝組分析可靠性的指南。現(xiàn)有的生物分析方法驗(yàn)證指南，包括四級框架，生物分析檢查清單如Box1所述。
建議的用于評估代謝組學(xué)分析方法可靠性的分級框架指南
考慮到代謝組學(xué)應(yīng)用廣泛，LC-MS技術(shù)不斷發(fā)展，很顯然有必要提出一個(gè)描述可靠性的統(tǒng)一框架，能勝任于不同的應(yīng)用。對是否符合目的的評估涉及到以下問題：（i）該分析的使用背景，即數(shù)據(jù)是用來做什么的；（ii）是定量、半定量還是相對定量分析；（iii）評估對不確定性的容忍度。建議的框架指南總結(jié)在Table 1，第1和第2級（Tiers 1 and 2）針對靶向代謝組學(xué)為本文的重點(diǎn)，所有用于評估的參數(shù)總結(jié)在Table 2。
第1級：經(jīng)過驗(yàn)證的方法
第1級驗(yàn)證涉及通過使用傳統(tǒng)的靶向代謝物分析進(jìn)行疾病和毒性表型的診斷，通常可以對一到十幾種代謝物進(jìn)行絕對定量。第1級驗(yàn)證是符合法規(guī)的臨床診斷機(jī)構(gòu)所必需的，這一過程需要每種代謝物都有相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)物（外標(biāo)）。
第2級：合格的方法
第2級定量涉及使用靶向代謝組分析對多余10種代謝物進(jìn)行絕對定量，用于疾病和毒理表型的診斷。同樣需要準(zhǔn)備每種代謝物的外標(biāo)，其方法檢驗(yàn)的標(biāo)準(zhǔn)不如第1級驗(yàn)證嚴(yán)格。
第3級：篩選方法
第3級篩選涉及疾病和毒性表型的篩查，主要通過使用多重靶向或混合代謝組學(xué)分析對數(shù)百個(gè)代謝物進(jìn)行相對或者半定量檢測。這并不需要每個(gè)代謝物都有相應(yīng)的外標(biāo)，用于篩選方法的標(biāo)準(zhǔn)不像第2級驗(yàn)證那么嚴(yán)格。
第4級：發(fā)現(xiàn)方法
第4級發(fā)現(xiàn)包括通過使用非靶向或混合代謝組學(xué)在實(shí)驗(yàn)中進(jìn)行相對定量以發(fā)現(xiàn)假定的代謝生物標(biāo)志物。非靶向方法的標(biāo)準(zhǔn)最不嚴(yán)格。可使用適合系統(tǒng)的QC樣品，研究內(nèi)QC樣品，實(shí)驗(yàn)室間QC樣品，對混合QC樣品進(jìn)行系列稀釋等。
靶向代謝組學(xué)分析和多代謝物檢測
靶向代謝組學(xué)研究通常需要對多種分析物進(jìn)行定量（包括絕對定量，半定量或者相對定量）來進(jìn)一步探索非靶方法鑒定的潛在生物標(biāo)志物和驗(yàn)證由此產(chǎn)生的科學(xué)假設(shè)。靶向與非靶向代謝組學(xué)之間的差別很小，通常有重疊。
LC-MS多靶分析允許在同一次分析時(shí)檢測多種分析物。雖然隨著分析物數(shù)量的增多，良好的準(zhǔn)確性和精密度很難保證，但多靶分析仍比單靶分析提供更多的關(guān)于生物標(biāo)志物的信息。如規(guī)章標(biāo)準(zhǔn)所述，在同一次分析中所有的定量分析物需滿足同樣的接受標(biāo)準(zhǔn)。如果一個(gè)分析物未能達(dá)到，則這個(gè)分析就是失敗的。然而，多靶代謝組分析中，如果大多數(shù)分析物符合檢測標(biāo)準(zhǔn)，沒有必要對所有代謝進(jìn)行重新分析。
此外，可視檢測代謝物的數(shù)量和分析的目的降低驗(yàn)收標(biāo)準(zhǔn) （Table 1）。一種考慮是可以將LLQQ的變異從20%增加到30-40%。有一點(diǎn)需要謹(jǐn)記，增加LLQQ重復(fù)樣品數(shù)量會使變異（RSD）變低，并且分析變異度的可容忍度取決于樣品的生物變異。分子量大的生物分子通常比小分子代謝物的變異要大，因此FDA推薦的大分子重復(fù)分析的變異要小于30%，而小分子則需要小于20%。在本文建議的框架下，第2級的驗(yàn)收標(biāo)準(zhǔn)更為寬松，因?yàn)橹貜?fù)樣品的數(shù)量較少。然而，如果當(dāng)檢測代謝物數(shù)量較多時(shí)，推薦增加第2級檢驗(yàn)的校正點(diǎn)。另外，生物標(biāo)志物應(yīng)同時(shí)評估其絕對定量和半/相對定量方法。
有關(guān)靶向、非靶向和混合代謝組分析產(chǎn)生高質(zhì)量數(shù)據(jù)的生物分析方面的考慮
在生物分析不同階段，良好的實(shí)驗(yàn)室規(guī)范的重要性都要給予重視。樣品、分析物和數(shù)據(jù)的完整性以及基本的實(shí)驗(yàn)記錄保存都是必不可少的。非常推薦大家使用實(shí)驗(yàn)室信息管理系統(tǒng)。實(shí)驗(yàn)儀器的日常校正、移液器和天平有書寫清楚并且標(biāo)準(zhǔn)的操作程序、合適空白樣品的選擇、內(nèi)標(biāo)、適合分析系統(tǒng)的測試和不同研究間的QC樣品都是必需的。批次間的QC樣品應(yīng)放置在正式分析中，分析樣品檢測順序被QC樣品分開，以確保整個(gè)分析的精度。推薦使用表型（比如健康 vs疾病）QC樣品。QC樣品通常是將少量的所有檢測樣品混合制成的，被用于整個(gè)分析過程中。對于非靶向分析，強(qiáng)烈建議使用系列稀釋的QC樣品以幫助區(qū)分來自LC-MS化學(xué)背景的生物特征。同位素標(biāo)記標(biāo)準(zhǔn)品的使用可以對不同研究的精度提供一個(gè)廣義的測量。此外，使用同位素標(biāo)記的內(nèi)標(biāo)可以幫助消除基質(zhì)導(dǎo)致的離子化效率的影響，因此可以提高分析的準(zhǔn)確性。推薦使用合適的替代基質(zhì)來提高生物標(biāo)志物定量的靈敏度和選擇性。條件允許的情況下，應(yīng)該使用含有最低含量內(nèi)源分析物的空白樣品。此方法適合多靶分析，但是每一個(gè)分析物的基質(zhì)效應(yīng)和穩(wěn)定性應(yīng)該予以研究。如果沒有空白樣品，標(biāo)準(zhǔn)加入法可以用來分析檢查回收和基質(zhì)效應(yīng)。使用QC或者準(zhǔn)備的標(biāo)準(zhǔn)品來檢測方法的準(zhǔn)確性和可重復(fù)性是一種假設(shè)最少的方法。人工準(zhǔn)備的空白基質(zhì)也可以使用，4% 脫脂牛血清白蛋白溶液（溶解在生理鹽水中）可以用作人血漿的空白基質(zhì)。用于校正樣品量不同導(dǎo)致差異的方法也應(yīng)予以考慮。比如，尿液肌酐常用于校正尿液生物標(biāo)志物的濃度。
所有的靶向分析都應(yīng)該對檢測限和定量限有明確的定義。必需有信號高于基線噪音清晰可辨的譜峰，譜峰要包含特定的數(shù)據(jù)點(diǎn)（通常大于等于6個(gè)數(shù)據(jù)點(diǎn)）。作為一般規(guī)則，定量限的信噪比（S/N）應(yīng)該≥5，檢測限S/N約為3。這一方法與國際機(jī)構(gòu)的要求是一致的。對于靶向分析，所有峰的信噪比都要進(jìn)一步確認(rèn)以保證其達(dá)到了要求。然而，對于大規(guī)模的代謝組分析，對每個(gè)峰進(jìn)行手動檢測并不現(xiàn)實(shí)。但是，如果某些代謝物或者特征被判定為離群點(diǎn)，那么這些譜峰需要先進(jìn)行人工檢查來確認(rèn)差異是真實(shí)的還是數(shù)據(jù)質(zhì)量問題。
