最新綜述丨Signal Transduct Target Ther生物標志物中的小分子
代謝表型
代謝異常導致的代謝途徑和代謝物功能紊亂是很多疾病的重要特征。代謝物特征可以用于疾病的診斷、預后預測和治療效果的監測。早期生物標志物的缺乏對疾病的診斷和治療都非常不利。因此，發展用于診斷和監測的高特異性、高選擇性的無創方法非常有必要。代謝組學已經成為發現代謝生物標志物和代謝物途徑分析的專業工具，可以發現多種疾病的潛在機制和治療靶點。代謝組學可以幫助鑒定與表型變化相關的功能性生物標志物，發現生化途徑變化，這些變化可以作為疾病早期診斷的輔助指標。最近，研究者已經進行了大規模的代謝組分析以期發現生物醫學治療中的潛在靶點。2023年3月，發表在nautre旗下的STTT上的這篇Review總結了基于代謝組分析發現的小分子代謝物作為臨床診斷、預后標志物的潛力，在藥物篩選和治療中的應用以及下一步突破所面臨的挑戰。文章標題為“Small molecule metabolites: discovery of biomarkers and therapeutic targets”，原文鏈接：https://doi.org/10.1038/s41392-023-01399-3。
來自人體生物體液的代謝物生物特征提供了基因型、環境和表型之間的聯系，是具有吸引力的用于臨床診斷、預后和疾病分類的生物標志物。差異代謝物可以提高患者診斷、監測、風險預測和預后的特異性和準確性。發現和鑒定小分子代謝物和代謝物途徑的改變對理解疾病的病理過程以及治療靶點的鑒定都非常有幫助。代謝組學技術的已經發展成為一種有效的無損、高通量檢測方法。主要方法包括代謝表型、代謝指紋、代謝輪廓和靶向代謝物分析。
01 先進的技術平臺
作為下游產物，小分子代謝物與特定的代謝表型相關，代謝組研究可以為疾病的機制研究和治療靶點的發現提供新的見解。代謝組主要包括分子量小于1500 Da的小分子物質。所有代謝物的水平都受生理活動和外源性環境因素影響，這使得代謝組學數據的解釋更為困難。技術的突破為探索疾病的代謝維度提供了新的契機，代謝組檢測的主要技術包括磁共振（NMR）和質譜（MS）。MS可以檢測低豐度的代謝物，最近正在發展空間分辨率的代謝物檢測技術。高通量的質譜成像技術可以同時檢測多種代謝物的空間分布，為理解復雜的交互網絡提供了具有吸引力的平臺。NMR主要用于生物標志物的表征和多種疾病的分類。目前，還沒有單一方法可以勝任檢測整個代謝組的任務。
代謝組學可以分為靶向代謝組學和非靶向代謝組學。非靶向代謝組學可以揭示以前未知的代謝信息，而靶向代謝組學則只分析一組代謝物，比非靶向代謝組學更靈敏，重復性也更好。由于代謝組的復雜性，數據分析需要對原始數據進行預處理，然后再進行多變量分析，組學數據挖掘和生物信息整合。較大的數據集需要專業的工具進行快速分析。自動注釋和數據庫建立等技術的進展可以解決這些問題。HMDB和KEGG是代謝物分析常用的數據庫，生物信息學工具可以自動處理代謝組數據。比如，MetaboAnalyst工具可以分析產生相互作用網絡和可視化圖，包括使用網絡拓撲方法進行多種通路分析和代謝物富集分析。
內源性代謝物由宿主和體內微生物合成，小分子代謝物可以通過分解代謝或合成代謝產生，比如肽、糖、氨基酸、核酸、有機酸、脂質和脂肪酸。代謝物是基因型和表型之間最為緊密的聯系，反映了基因組、蛋白質組、轉錄組、表觀基因組，以及其與環境的相互作用。一旦與疾病病理生理相關的特定代謝物被鑒定出來，人們會進一步研究生物標志物相關的機制通路，并采用無創的方法來監測疾病的發展和區分患病人員。由于代謝組的化學復雜性和動態范圍，同時鑒定和可靠定量代謝特征非常復雜。生物標志物的鑒定能促進疾病的診斷和預后判斷、個體化治療，能更好的理解和探索疾病發展或者藥物調節相關的潛在分子途徑和機制。鑒于代謝輪廓的改變，小分子的定性和定量研究技術為鑒定有潛力的生物標志物和預測模型提供了絕佳的機會。
主要用于檢測小分子的分析平臺包括NMR、LC-MS和GC-MS。每種技術在靈敏度、準確度、分辨率、動態范圍、重復性和通量方面都有其獨特的優勢�；谫|譜的方法可以檢測一系列生物活性代謝物。MS掃描、高精度MS/MS分析與數據庫（比如HMDB和METLIN）相結合可以提供大量的相對離子豐度，獲得更可靠的鑒定。此外，高度復雜數據還需要分析軟件來完成代謝物的鑒定和代謝通路分析。XCMS Online、Open-MS、MZmine和MS-DIAL軟件可用于峰檢測和校準。
NMR數據處理可以使用NMRbox來完成代謝物鑒定。軟件工具和大量的譜圖數據庫有助于通過一維NMR和二維NMR譜圖進行代謝物鑒定。然而，結合核磁共振和質譜數據極大地提高了代謝組的覆蓋率，并增強了代謝物鑒定的準確性，有利于提高數據質量。
很多研究組致力于開發在線工具用于統計和生物信息分析，比如Metlin、MetaboAnalyst和KEGG。相關性分析反映了代謝物與臨床特征之間的關聯性，并進一步評估了潛在的代謝差異。為了找到一組代謝物作為某種特定情況下的可能生物標志物，每個代謝物需要進行獨立分析來確定其診斷能力。根據最新的HMDB 5.0數據的信息，一共有24368種代謝物被發布。尿液和血液中分別檢出了5661和38036種代謝物。近幾十年來，在疾病的發展中，許多相關小分子代謝物已經被發現，這些研究需要強調代謝物的生物活性，并提供它們相關的生物學意義。
02 探索表型特征
了解每一個病人，而不是所有病人平均的代謝圖譜表征將有可能用于精準治療。代謝輪廓是許多不同代謝物的集合，可以使用小分子代謝物作為指數來描述人類表型的生化狀態。具體代謝表型的闡明對于鑒定潛在的生物標志物和藥物靶點，以及更好的理解潛在的病理機制都至關重要。
病人的代謝輪廓是動態變化的，受生活方式、疾病、外部或內部刺激、生理和病理情況變化影響。生物體液的代謝輪廓可以直接反映不同組織和器官的特定代謝狀態，也可以決定不同病人亞組的代謝特征。代謝變化作為早期診斷和潛在治療的生物標志物靶標，對調節新陳代謝起顯著的病理作用。
03 有前景的生物標志物
根據NIH的標準，生物標志物定義為可以測量作為生理、生物、病理或者藥理過程指標的特征。生物標志物具有可以量化、可檢測和與人類表型相關的特征；可以用于早期診斷，提高治療效果和治療策略的合理性，并且能降低與疾病相關死亡率，有助于發現新的治療靶點。目前臨床使用的生物標志物仍缺少足夠的靈敏性和特異性。因此，要提高患者的管理水平，需要發現更精準的體液生物標志物。
近年來，人們發現了多種生物標志物用于早期疾病發現和預測疾病進展、臨床結局或藥物反應。生物標志物可以是一組代謝物、一種代謝物或者一種分子特征。疾病的出現表明代謝物濃度的異常是系統代謝通路穩態受到破壞的一種征兆。因此，與蛋白質和基因不同，代謝物作為生化活性特征與人類表型密切相關。
由于診斷不準確和對病理生理過程的了解有限，代謝紊亂的精準治療仍然是一個巨大的挑戰。研究小分子生物標志物對精準治療非常必要。建立生物體液的內源性代謝生物標志物的定量指紋圖譜有助于建立疾病進程和代謝變化之間的密切關系。目前，使用特定代謝物特征對處于初始階段的疾病進行快速檢測仍然面臨巨大挑戰。先進的平臺，特別是使用LC/MS/MS，有助于小分子代謝物的檢測、定量和表征，并且很大程度上提高了它們的轉化能力。
目前篩選出來的一些有代表性的潛在生物標志物總結出來。六種代謝物的組合（β-丙氨酸、同型絲氨酸、3-羥基犬尿氨酸、天冬氨酸、酪氨酸和鳥氨酸）被量化為潛在的血液生物標志物，被認為是帕金森疾病診斷和預后的潛在分析方法。循環代謝物：谷氨酰胺、酪氨酸、脯氨酸、組氨酸、丙氨酸和檸檬酸與乳腺癌發展有顯著相關性。一個由兩個潛在預測血清代謝物（棕櫚酰胺和去氧膽酸）被報道為克羅恩病患者的潛在生物標志物，它的代謝紊亂包括脂肪酸，膽汁酸生物合成和能量代謝。此外，隨著相關分析和ROC曲線分析的使用，特征代謝物包括丙氨酸、葡萄糖、乳酸、甘氨酸和蘇氨酸在肺動脈高壓患者中被鑒定出來，蘇氨酸和乳酸與肺血管阻力和動脈壓顯著相關。5-氧脯氨酸可以作為急性缺血性休克的重要生物標志物。小分子代謝物包括LysoPC(15:0)、二十二碳五烯酸、丙基肉堿、LysoPC(14:0)和苯丙氨酸為代謝異常和代謝綜合征的危險因素。據報道，與Akt相關的候選生物標志物花生四烯酸和13(S)-HODE是非小細胞肺癌的潛在生物標志物。
及時診斷是至關重要的，小分子代謝物的篩查可能在疾病診斷中起到關鍵作用。小分子代謝物是生理過程的末端產物，因此探索整個代謝組可以更好的了解疾病病理和干預機制。組學方法結合模式識別可以用于早期疾病診斷生物標志物的發現。
04 疾病分類和分級
臨床醫生需要快速并準確地評估疾病分級的風險。近來，多種組學結合的方法作為一種很有前景的方法檢測早期代謝變化，可能會用于疾病分類、分級和進展評估。選擇合適的與病理狀態相關的代謝物有助于做決定，降低從探索測試到臨床的花費。內源性代謝物篩選結合傳統風險評估可以在出現癥狀之前發現代謝表型的變化，具有提高無創診斷和疾病分類的潛力，很有希望走向臨床。代謝物指紋具有預測疾病風險的能力，大數據結合人工智能或者大數據挖掘將對疾病分級分析具有重要意義，可以作為一個智能工具幫助臨床醫生做決定。
已經有大量的隊列研究去幫助建立更有效、更可靠的用于疾病分級危險事件的評估模型。肌酸、脯氨酸和棕櫚酸在胰腺導管腺癌與良性組織的區分中表現出一定潛力。一些小分子代謝物，比如吲哚丙烯酸、酪氨酸、視黃醇、辛烷基肉堿和癸烷基肉堿被發現有較高的AUC值，表現出較好的能力區分肺轉移癌癥和其他亞型。代謝組和脂質組整合分析發現D-甘油酸、皮質醇、2-（甲基硫代）乙醇、N-乙酰組胺可以構建模型用于鱗狀癌和非小細胞肺癌的精確病理分類。絲氨酸和乳酸建立的模型可以預測唾液腺腫瘤的良性和惡性程度。兩種尿液代謝物皮酮四醇和四氫可的松對髓母細胞瘤的診斷和檢測表現出較高的準確性。使用三磷酸硫胺素、糖尿病持續時間和收縮壓建立的諾模圖可以用于糖尿病視網膜病變的早期診斷和精準預測。氨基酸、能量、脂質代謝的改變能區分穩定型和不穩定型冠狀動脈粥樣硬化心臟病�；诟叻直媛寿|譜的組織空間代謝組學用于胃癌亞型分類。尿液代謝物N-甲基乙內酰脲、4-羥基苯甲酸酯、肌酐、乙酸和谷氨酰胺區分前列腺癌、膀胱癌和腎細胞癌具有較高的準確度。此外，代謝物或者代謝物組合在鑒別甲狀腺乳頭狀癌與良性癌，區分新冠早期和終末期，鑒別子宮內膜息肉與內膜增生或者子宮內膜癌方面以及其他疾病的診斷和分級中均表現出極大的潛力。
05 實現精準治療
沒有一種特定的治療方法可以滿足所有的病人需求。因此，通過預測治療效果，給予每個病人合適的治療是臨床所必需的。新的技術對發現有效的和有潛力的用于指導病人管理的生物標志物至關重要。代謝物輪廓分析可以系統的分析代謝物，用于預測和監測藥物治療的反應，發現藥物靶點，個體化治療以減輕疾病負擔。代謝特征可以為靶向代謝途徑或者精準藥物治療提供大量的信息。獨特的代謝物特征對鑒定不同的治療反應非常有用（Table 1）。
06 代謝網絡研究
大多數天然產物通過影響多個而不是單個靶點發揮生物活性。代謝組學已被用于檢測生物樣品中意想不到的代謝變化，了解代謝過程和探索網絡靶點和機制。此類分析過程總是產生越來越復雜的大數據集，導致處理、分析和解釋小分子代謝物之間的關系成為主要的挑戰。小分子代謝物的關聯信息關系的生物學解釋可以總結為基于已知的代謝網絡。在代謝網絡中，特征代謝物作為節點，而相關代謝物做為邊連接起來。整合多層網絡將有助于提高代謝物的鑒定，衍生出新的生物學解釋。一旦共同調節代謝物的代謝網絡被建立起來，就可以使用先進的算法對代謝信息進行挖掘。最近使用多網絡構建和基于圖形的方法來執行拓撲分析聚焦于代謝過程或感興趣表型相關代謝物數據的發掘。根據所鑒定的代謝物的相似性或相關性，圖形分析、先進的統計方法和數據分析可以用來探索相互關聯的數據，揭示代謝物在生物樣本中關系。過去的幾年中，面向多靶點化合物的基于網絡的方法已成為重要的工具，因其具有確定和研究新藥靶點和復雜關系的潛力�！熬W路藥理學”專注于從“一個靶點一個藥物”的理念向“靶點網絡組成”轉變，進而對抗復雜疾病。生物信息學和高通量篩選方法有助于各種藥物靶點網絡的預測，對揭示藥物作用機制越來越重要。對不同代謝途徑的系統分析來鑒定新的靶點可能克服現代藥物設計的陷阱，有助于理念的轉變，開發新的診斷和靶向治療工具。
07 療效評價
代謝組學在發現用于評估治療效果的生物標志物方面發揮著重要作用。深入研究小分子代謝物可以指導藥效評估，藥物開發和藥物安全性評價。選擇最有效的治療藥物是非常重要的。在用藥之前，鑒定小分子代謝物作為與藥物反應相關的生物標志物將極大降低治療的經濟成本。這與我們需要篩選代謝物用于確定每一階段的治療效果和發展更有效的治療策略的理念一致。血中犬尿氨酸水平的降低可能提示艾司西酞普蘭的治療反應，提示它可能參與艾司西酞普蘭治療導致重度抑郁的病理生理反應。血清代謝產物包括精氨酸和花生四烯酸可以作為乳腺癌的診斷性生物標志物，預測曲妥珠單抗的治療效果。藥用植物通常依賴于復雜的成分，是治療代謝紊亂的重要資源。然而，由于復雜組分和多分子靶點，草藥和復方藥的作用分子機制仍不清楚，常規方法對藥物療效的評估不夠靈敏。關于中草藥調控代謝的機制可以幫助預測和理解藥物的功效和毒性。研究表明，代謝組學可以進一步用于鑒定活性化合物和靶點來助力新的治療方法的開發。
08 活性成分發現
在過去的幾十年里，有一半以上的新藥和藥物先導化合物都是從天然產物中提煉出來的。在臨床上，草藥產品與常規藥物聯合使用可以改善藥理作用。由于其復雜性，天然產物中的活性成分或者藥物先導物的鑒定一直具有挑戰性。雖然已取得重大進展，發現新的活性成分的一個主要挑戰是藥理機制不清楚。藥用植物如草藥提取物、復方制劑和不同的化合物通過調節代謝紊亂和機制途徑來發揮藥理作用。高通量代謝組學符合中草藥復雜療效的整體觀點和機制見解。探索草藥衍生的生物活性成分對機制研究、代謝通路改變和發現代謝疾病的治療靶點尤為關鍵。
由于天然化合物具有靶向代謝的能力和多樣的結構，其作為潛在的治療制劑越來越引人注意。各種草藥衍生的生物活性化合物可以針對代謝調節機制并表現出治療潛力。高分辨率預測技術或可視化方法增強了篩選和驗證天然先導化合物的能力。生物活性化合物可以在特定表型中靶向小分子代謝物相關的代謝過程，調節不同途徑的代謝活動，對高度復雜疾病的治療具有重大潛力。
09 活性成分的代謝過程
來自草藥的植物化學物質作為天然產物具有健康效應已經廣為人知，但是它們的活性和潛在機制仍有待深入研究。為了研究植物化學物質的藥理作用需要重點解決如下問題：如何檢測低含量的活性成分；如何闡明代謝途徑；如何揭示體內總體代謝過程和效應機制。整個過程非常復雜，因為體內有大量的代謝反應，同時產生多種代謝物。體內代謝過程研究對確定藥效的多成分特點和指導新藥研發，或加速從天然產物中發現新藥都非常重要。由I相和II相反應以及腸道菌群介導的生物轉化直接影響藥效，對確定活性成分的藥代動力學參數至關重要。體內代謝參數，包括Cmax, Tmax, t1/2, and AUC0-t為最常用的參數。
由于現代質譜與色譜串聯分析技術具有較高的靈敏度和穩定性，其在研究活性成為體內代謝過程中發揮著舉足輕重的作用。非靶向代謝組學篩選策略重點關注體內代謝物在給藥組和空白對照中的差異，進而探索劑量-效應關系。選擇與治療效果相關的體內代謝物作為藥理學指標來反應整體藥效具有重要意義。由于有效成分的復雜性和對效果貢獻權重的不同，有必要在體內進行研究多種活性成分組合的代謝過程，從而可以指導臨床實踐。基于建立的體內代謝網絡，與小分子代謝物高度相關的活性成分標志物可以通過分子網絡技術有效地篩選出來。活性成分適當的混合可以通過代謝表型篩選被優化，其靶點和分子機制可以通過網絡藥理學、人工智能或計算機對接來揭示。
10 代謝穩態和腸道菌群
越來越多的證據表明，體內平衡依賴于與腸道菌群的相互作用。腸道菌群可以產生多種代謝物作為宿主和微生物之間的信使。腸道微生物群作為一個“看不見的器官”，通過它們的受體信號來調節產生活性代謝物進而影響宿主的新陳代謝。腸道菌群紊亂可以影響各種器官，導致代謝疾病。腸道菌群失衡與疾病機制密切相關，這意味著調節腸道菌群是一種新的治療方法。腸道菌群作為一個不可或缺的“器官”可以調控藥物代謝，影響其生物利用度和治療效果。天然產物可以改變腸道菌群構成和其代謝物，這一過程在藥物研發時可以增強藥效并減少副作用。天然產物主要在腸道中被代謝和吸收，次生代謝物可調節代謝擾動。
腸道菌群通過體循環來影響宿主血管的病理過程和能量穩態。菌群失衡導致的能量代謝紊亂在疾病發展中起關鍵作用。比如，短鏈脂肪酸可以激活細胞信號通路對調控能量代謝發揮有益作用。腸道菌群與膽汁酸的相互作用作為信號調節因子對疾病進展有深遠影響（圖3）。腸道菌群可以產生多種小分子代謝物，它們作為信使分子在維持宿主穩態和影響疾病狀態中發揮重要作用。有一些代謝物只能由腸道菌群產生，腸道菌群可以代謝初級膽汁酸，對腸道疾病具有保護作用。代謝生物標志物可用于分析腸道菌群構成與代謝之間的相互作用。
膽汁酸與腸道微生物相互作用參與宿主代謝
11 影響因素
代謝受各種內源和外源因素影響，代謝物也受性別、年齡、體重、營養、藥物、生活方式和晝夜節律的影響。這些因素難以監測，可能是代謝生物標志物研究中最具挑戰性的原因。雖然潛在的代謝標志物用于診斷和治療的篩查取得了很大進展，但其可行性還需要大量的隊列研究驗證。代謝物在人類和實驗動物之間的差異也應予以考慮。代謝組受遺傳因素、腸道菌群和環境暴露影響。代謝組學與基因組學、蛋白質組學或者轉錄組學不同，可以快速準確地反映出生物體清晰的表型狀態，但它受外部混雜因素的影響。
12 展望與結論
代謝組學是一門相對年輕的學科，目前檢測方法代謝物的覆蓋范圍仍然有限，使得最終結果的解釋不充分。因此，多種檢測平臺的有機整合和其他組學數據的整合分析是未來主要的發展方向。然而，由于代謝途徑的復雜性和數據與代謝網絡之間的相互作用，多組學數據的整合仍是一個巨大的挑戰。由于代謝標志物易受環境因素影響，仍然很難在保持代謝物原本代謝狀態下對其進行快速分離。需要提高檢測精度和準確度來實時分析整個代謝組。打破技術瓶頸來提高代謝組檢測的覆蓋度、靈敏性和準確性仍需要大量的努力。未來研究應重點解決如何整合疾病代謝表型，并將其用于臨床診斷和治療。大型前瞻性臨床試驗可以驗證發現的具有較高轉化機會的小分子代謝物。為了更好的研究表型背后的機制，未來的挑戰將包括不同數據集的標準化、檢測方法的標準化以及新算法的開發等。借助強大的人工智能或大數據分析、機器學習的幫助，可以更好地理解病理途徑和代謝相關疾病的機制，為臨床決定提供切實可行的方法，加快代謝物和代謝表型在臨床應用中的進程。了解代謝物的空間信息對疾病的理解也非常重要，高分辨率的代謝成像技術也將是未來發展的重點之一。
異常代謝物可作為潛在的生物標志物評估診斷和監測治療反應和預后，將為今后的精準醫學提供充足的依據。疾病中人體多種代謝途徑發生改變，其可能是進一步臨床試驗潛在的靶點。代謝組提供了一個全面、動態和精確的代謝表型，可以賦予個性化臨床實踐。眾多研究在進行基于代謝組學的發現，識別獨特的代謝特征，有助于了解生理或病理生理過程中的復雜代謝物網絡。可以預見的生物醫學應用包括監測健康和疾病，評估疾病嚴重程度或藥物開發，預測時間進程，監測疾病進展，預測潛在的治療方法，并加以闡明疾病機制。接下來的研究應該提高潛在生物標志物的診斷和預測能力。另外，未來的方向是解決臨床應用相關的問題，比如建立代謝譜與臨床參數之間的關系。今后的努力還應增加代謝物鑒定的可信度，確定代謝生物標志物的臨床可應用性，為未來精準醫療開辟新徑。
