合作文章丨J Pharm Anal酰基肉堿定量方法開發
酰基肉堿主要來源于線粒體、過氧化物酶體和內質網中的脂肪酸和支鏈氨基酸。根據酰基鏈長度可分為短鏈(C2-5)、中鏈(C6-12)、長鏈(C13-20)和超長鏈(> C20)酰基肉堿，其中部分酰基肉堿的酰基鏈上含有羥基、羧基或側鏈甲基，或與許多親水性化合物（包括氨基酸、葡萄糖醛酸和磺酸）共軛。這些酰基肉堿不僅在脂質和氨基酸的代謝穩態、脂肪酸運輸和宿主-微生物共生等方面發揮著重要作用，而且部分酰基肉堿作為2型糖尿病、心血管疾病、阿爾茨海默病、非酒精性脂肪性肝病、腫瘤和先天性代謝缺陷的生物標志物。然而，各種酰基肉堿的結構和物理化學性質存在巨大差異，目前仍然缺乏高通量高覆蓋的酰基肉堿定量方法用于支鏈、羥基化、羧化和共軛酰基肉堿的功能研究。
超高效液相色譜-質譜聯用法（UPLC-MS）在同時定性定量酰基肉堿方面具有巨大的潛力。超高效液相色譜-高分辨率質譜法（UPLC-HRMS）受限于掃描速度和動態范圍，故對于含有多不飽和、羥基化和羧化酰基鏈的低豐度酰基肉堿具有較低的定性定量準確性。相對地，多反應監測模式（MRM）目前作為超高效液相色譜串聯質譜（UPLC-MS/MS）定量分析的最佳選擇，存在熱不穩定性、覆蓋度低、通量低或異構體區分有限等問題。因此，所有報道的UPLC-MS/MS方法只覆蓋了少數羥基化和羧化的酰基肉堿，而沒有共軛的酰基肉堿。此外，基于UPLC-MS/MS的高覆蓋酰基肉堿定量方法的主要瓶頸之一是缺乏可靠的標準品來獲得所有可能的酰基肉堿的保留時間（tR）。然而，定量結構-保留關系（QSRR）建模雖然有助于預測酰基肉堿tR，但這類研究只考慮了酰基鏈上的碳原子和雙鍵數量。
復旦大學人類表型組研究院分子表型代謝組平臺唐惠儒教授團隊首先開發了一種基于UPLC-MS/MS結合MRM采集模式的定量方法，可用于在10分鐘內同時定量生物體液和組織中所有可識別的酰基肉堿。然后，利用酰基肉堿7個結構特征，構建了其tR值的QSRR模型用于預測更多酰基肉堿的tR值，從而進一步建立了文獻中檢測到的1136種酰基肉堿的MRM參數（tR、MRM離子對與碰撞能量值）數據庫。最后，該團隊進一步定量了兩種典型人體生物體液（血漿和尿液）和五種典型動物模型組織中的酰基肉堿，以揭示其分子表型特征。
研究方法
首先，采用異丙醇/水溶液提取不同生物基質中酰基肉堿。再者，采用UPLC-QTOFMS定性分析酰基肉堿標準品的tR與特征碎片，并鑒定出不同生物基質中酰基肉堿種類。然后，基于R語言中LM函數來構建酰基肉堿tR值的QSRR預測模型、并建立文獻中檢測到的1136種酰基肉堿的MRM參數（tR、MRM離子對、碰撞能量）數據庫。最后，經方法學考察，對多種生物基質中酰基肉堿進行定量分析與分子表型描述。
研究內容
1. 基于UPLC-QTOFMS多種基質酰基肉堿分析
相比負離子模式，在正離子模式下所有酰基肉堿均產生更強烈的信號，包括母離子[M]+（源于左旋肉堿季銨陽離子）、[M-59.0735]+（N(CH3)3的中性損失）和來自左旋肉堿部分的三個特征碎片（m/z 144.1019、85.0284和60.0808）。同時，所有共軛酰基肉堿均產生母離子[M]+、[M-共軛物-59.0735]+和來自肉堿部分的三個特征碎片。由于特征碎片m/z 85.0284響應值均最強，故 [M]+/85.0284可作為酰基肉堿的MRM定量離子對。[M-共軛物-59.0735]+是共軛酰基肉堿唯一的高響應特征碎片，故[M]+/[M-共軛物-59.0735]+可用于作為定量MRM離子對。基于上述MRM定性定量分析方法，多種生物基質（兔肝組織、人源血漿、尿液和細胞）及其混合樣品中鑒定出471種酰基肉堿，其中包括395種酰基肉堿和76種共軛酰基肉堿。
圖1 （A）酰基肉堿（C10:0）與（B） N -乙酰半胱氨酸共軛-羥基酰基肉堿（N-acetylcys-C10:1-OH-CA）在正離子模式下的碎裂模式。
2. 酰基肉堿定量結構-保留關系(QSRR)和MRM參數數據庫
利用R語言中LM函數構建了該色譜條件下酰基肉堿的QSRR模型（式3），45種酰基肉堿標準品的計算保留時間（tRC）與實驗結果（tRE）具有良好的線性相關性（r2> 0.998）和準確性（△tR< 0.20 min，MAE < 0.07 min）。該模型對于混合樣品中檢測到的所有211個酰基肉堿均具有良好的tRC與tRE相關性（r2 ~ 0.984）和預測精度（MAE< 0.21 min和△tR < 0.9 min），其中包括不同酰基碳鏈、支鏈甲基、碳碳雙鍵、羥基或羧基數目的酰基肉堿。即使在這些結構特征同時存在的情況下，從混合樣品中鑒定出97%酰基肉堿的tRC與tRE相關性和準確性均優。基于此，一個MRM參數（tR、MRM離子對和碰撞能量）數據庫被進一步建立，其中涵蓋了含398個化學結構式的1136種酰基肉堿（包括酰基肉堿、共軛肉堿及其異構體）。
tRC = k0 + k1c3 + k2c2 + k3c + k4b+ k5d + k6h + k7j+ k8p + k9q+ k10ch (式 3)
（其中，k0 = –0.252, k1 = 8.54×10–4, k2 = –4.82×10–2, k3 = 1.06, k4 = –0.487, k5 = –0.172, k6 = –1.65, k7 = –1.55, k8 = 0.152, k9 = –1.59×10–2與k10 = 7.20×10–2。模型中變量c、b、d、h、j分別表示酰基鏈碳、支鏈甲基、碳碳雙鍵、羥基、羧基的個個數，p、q表示支鏈和雙鍵的位置。）
圖2（A）45個酰基肉堿標準品與（B）生物樣品中檢測到的酰基肉堿模型計算保留時間（tRC）與實驗結果（tRE）的比較。
3. 多種生物基質中酰基肉堿的定量分析以表征其分子表型
在2種典型的人源生物液體（血漿和尿液）和5種小鼠組織（腎臟、肝臟、心臟、肺和肌肉）中共定量出514種酰基肉堿，用于表征其酰基肉堿分子表型。其中，人源尿液樣本中含有421種酰基肉堿多于人源血漿（149種）和小鼠組織（包括腎211種、肝195種、心臟189種、肺188種與肌肉169種），特別是共軛酰基肉堿與含有羥基和羧基的酰基肉堿。
圖3 多種生物基質中不同類型的飽和（sAC）、不飽和（uAC）、羥基化（AC-OH）、羧化（AC-DC）與共軛酰基肉堿（CAC）的濃度（c）。其中粗線（sum）與細線表示每類總濃度與每種濃度分布。
全文總結
建立的高通量UPLC-MS方法可實現多種生物基質中數百種酰基肉堿和共軛酰基肉堿的定量分析。同時，構建的定量結構-保留關系模型，可用于無標準品條件下酰基肉堿的tR值預測。最后，該定量方法通過量化2種人源生物體液與5種小鼠組織中500多種酰基肉堿，不僅為這些生物基質的分子表型提供了數據，也為大型隊列疾病研究提供了一種重要且可靠的分析技術。多種生物基質的高通量高覆蓋酰基肉堿定量方法于2023年10月發表在醫學領域期刊J Pharm Anal上(online)。
